四種杜鵑花粉生活力和柱頭可授性研究

童俊等

摘要：采用離體萌發(fā)法和聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定了4個杜鵑花（Rhododendron L.）品種琉球紅[Rhododendron obtusum （Lindl.） Planch. cv. Liuqiuhong]、大鴛鴦錦（R. obtusum cv. Dayuanyangjin）、小青蓮（R. obtusum cv. Xiaoqinglian）、胭脂蜜（R. obtusum cv. Yanzhimi）的花粉生活力和柱頭可授性，研究了開花特性、花粉保存時間和柱頭發(fā)育情況。結(jié)果表明，適宜測定這4個杜鵑花品種花粉萌發(fā)的液體培養(yǎng)基為300 mg/L Ca（NO3）2·4H2O + 200 mg/L MgSO4·7H2O + 100 mg/L KNO3+100g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3，4種杜鵑花的新鮮花粉萌發(fā)力依次為大鴛鴦錦>胭脂蜜>琉球紅>小青蓮。低溫有助于延長杜鵑花的花粉生活力，但同一品種在4 ℃和-18 ℃低溫保存條件下花粉生活力無顯著差異。大鴛鴦錦和胭脂蜜花粉低溫貯藏30 d后仍有一定的生活力，是較好的雜交父本材料。琉球紅花粉低溫貯存30 d后生活力降到5%以下，不能用作父本進(jìn)行授粉。琉球紅在花后6～8 d柱頭可授性最強，其他3個品種均在花后5～9 d柱頭可授性最強，此時柱頭分泌大量黏液，為授粉最佳時期。

關(guān)鍵詞：杜鵑花（Rhododendron L.）；開花習(xí)性；花粉生活力；柱頭可授性

中圖分類號：S685.21；Q944.58；Q944.42 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4232-05

杜鵑花（Rhododendron ssp.）為杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron L.）常綠或落葉灌木，其品種繁多，花色絢麗，花、葉兼美，是中國十大傳統(tǒng)名花之一。在園藝學(xué)范疇里具有樹形美觀、花葉形態(tài)多樣、色彩艷麗多變、花期較長等特點，園林應(yīng)用類型豐富，地栽、盆栽皆宜。中國具有豐富的杜鵑花種質(zhì)資源，素有“杜鵑花王國”的美譽[1]。時至今日，培育杜鵑花新品種的主要途徑仍然是常規(guī)雜交育種，國內(nèi)外育種學(xué)家通過雜交手段培育出了種類繁多的杜鵑花新品種。相對于野生原種，園藝栽培種一般分為春鵑、夏鵑、西鵑、東鵑和高山杜鵑花5大類型[1]，目前市場上常見的是西鵑，西鵑品種一般為復(fù)色、花量大、花期長，深受人們喜愛，但其生長適應(yīng)性弱于其他品系，在武漢種植表現(xiàn)為不耐熱。近年來武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所從杜鵑花的東鵑類型中優(yōu)選出了琉球紅[Rhododendron obtusum （Lindl.） Planch. cv. Liuqiuhong]、大鴛鴦錦（R. obtusum cv. Dayuanyangjin）、小青蓮（R. obtusum cv. Xiaoqinglian）、胭脂蜜（R. obtusum cv. Yanzhimi）4個耐熱杜鵑花品種[2]，若將西鵑和耐熱東鵑品種進(jìn)行雜交，有望創(chuàng)制出新的品種，從而可改良杜鵑花品質(zhì)。國內(nèi)現(xiàn)在關(guān)于杜鵑花花粉的保存及生活力測定的研究[3-6]較多，但對其柱頭可授性的研究鮮見報道。試驗通過探討東鵑品種的花粉生活力，觀察開花過程中柱頭形態(tài)的變化，測定柱頭可授性，確定授粉的最佳時期，以期提高雜交結(jié)實率，進(jìn)而為杜鵑花雜交選擇父本材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2013～2014年在武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所武湖基地杜鵑花資源圃進(jìn)行，以琉球紅、大鴛鴦錦、小青蓮、胭脂蜜4個東鵑品種為研究對象，試驗材料均為生長健壯的三年生植株。其主要特征是體型矮小，4月開花，著花繁密，花瓣均為夾套型。試驗在盛花期晴天上午10：00左右采集各品種當(dāng)天開放的花朵作為試驗材料，放入牛皮紙袋后迅速送回實驗室。供試試劑有Ca（NO3）2·4H2O、MgSO4·7H2O、KNO3、H3BO3、蔗糖、聯(lián)苯胺、過氧化氫等，都為分析純。儀器主要有全自動光照培養(yǎng)箱、冰箱、生物顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配制 采用Brewbaker-Kwack培養(yǎng)基[5]并參照張超儀等[6]的方法稍做改良，配制4種試驗用液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基基本成分為Ca（NO3）2·4H2O+MgSO4·7H2O+KNO3，在基本成分中添加不同濃度的H3BO3和蔗糖組成試驗所用的4種培養(yǎng)基，具體見表1。各培養(yǎng)基pH都在6.0左右。

1.2.2 離體花粉生活力測定 在實驗室內(nèi)于凹槽載玻片上滴取配制的液體培養(yǎng)基，用解剖針蘸取各杜鵑花品種開花當(dāng)天的新鮮花粉，移至培養(yǎng)基表面，將載玻片放入鋪放濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔4 h取出載玻片置于顯微鏡下觀察萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)后，每隔1 h觀測1次，以2次測定萌發(fā)率基本相同的時間作為最終測定結(jié)束時間，確定花粉離體萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基和萌發(fā)時間，統(tǒng)計萌發(fā)率。以花粉管長度超過花粉粒直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，萌發(fā)率=某視野已萌發(fā)的花粉粒數(shù)目/該視野花粉?？倲?shù)×100%。各處理都設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)隨機測3個視野，每個視野的花粉數(shù)不少于50粒，結(jié)果取平均值。

1.2.3 花粉貯藏力測定 以琉球紅、大鴛鴦錦、胭脂蜜3個品種的新鮮花粉為研究對象，用鑷子將花藥取下，分別置于常溫（23 ℃）陰涼處、4 ℃低溫冰箱和-18 ℃低溫冰箱中貯存?zhèn)溆?。?.2.2篩選出的最適培養(yǎng)基測定各品種在不同溫度下貯藏1、3、6、9、13、20、30 d的花粉生活力，方法同前。若花粉生活力降到5%以下則認(rèn)為不適宜進(jìn)行授粉，從而確定花粉貯藏力的高低。

1.2.4 開花過程形態(tài)觀測 在杜鵑花資源圃里對參試的4個東鵑品種各選擇3株盛開的樣株，掛牌標(biāo)記，記錄每個品種單朵花開放的天數(shù)，從開花第一天起至花謝，每天取開花各階段的新鮮單花各30朵，觀察記錄花柱形態(tài)、柱頭顏色、柱頭發(fā)亮及分泌黏液的情況，測量花徑大小、花筒長度和花柱長度，了解花柱在開花過程中的形態(tài)變化規(guī)律。

1.2.5 柱頭可授性研究 采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性[7，8]。具體是在上午10：00采集盛花期開花后不同天數(shù)的花朵各30朵，用鑷子取下柱頭，將其浸入含有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22，體積比）的凹玻片凹陷處，10～20 min后用放大鏡觀察柱頭染色的部位，將柱頭及周圍的反應(yīng)液呈現(xiàn)藍(lán)色并伴有大量氣泡出現(xiàn)的情況記為柱頭具有可授性，根據(jù)染色強弱和氣泡量劃分可授性能力強弱，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①“+++”表示柱頭可授性強，柱頭上至少有2/3的部位呈現(xiàn)出藍(lán)色并伴有大量的氣泡出現(xiàn)；②“++”表示柱頭可授性較強，柱頭上至少有2/3部位呈現(xiàn)出藍(lán)色并伴有較多氣泡出現(xiàn)，但比“+++”的少；③“+”表示柱頭具有可授性，但可授性弱，氣泡僅少量，藍(lán)色也不太明顯；④“-/+”表示部分柱頭具有可授性，部分產(chǎn)生少量氣泡，藍(lán)色不太明顯；⑤“-”表示柱頭不具有可授性，柱頭未出現(xiàn)染色反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Office Excel 2007軟件進(jìn)行處理和繪圖，采用SAS 8.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉生活力測定

在試驗培養(yǎng)4 h后，就在2號和3號培養(yǎng)基上開始有花粉萌發(fā)；培養(yǎng)16～17 h后，花粉萌發(fā)量達(dá)到最大且保持不變，各培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)情況見表2。從表2 可見，當(dāng)硼酸濃度在100 g/L時，各品種花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的升高大部分顯著升高（P<0.05）；當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到100 g/L時，各品種的花粉萌發(fā)率達(dá)到最大。當(dāng)固定蔗糖濃度為100 g/L時，硼酸濃度從100 mg/L增加到150 mg/L時，花粉萌發(fā)率顯著下降（P<0.05）。說明2號和3號培養(yǎng)基的效果最好，且2種培養(yǎng)基對琉球紅、大鴛鴦錦和胭脂蜜的花粉萌發(fā)影響差異不顯著（P>0.05）。1號和4號培養(yǎng)基只有極少量的花粉萌發(fā)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2號和3號培養(yǎng)基的萌發(fā)量。故以2號培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗花粉生活力測定的最適培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為17 h。

以2號培養(yǎng)基測定各品種開花當(dāng)天的花粉生活力，結(jié)果在供試的4個品種中，大鴛鴦錦的花粉生活力最高，達(dá)95.60%，其次是胭脂蜜；胭脂蜜為大鴛鴦錦的芽變品種，兩者形態(tài)相似，僅花色有些差異，故花粉生活力也相近，所以這2個品種適宜作雜交父本。琉球紅的花粉生活力中等，較適宜作雜交父本。小青蓮的花粉生活力顯著低于其他品種（P<0.05），且該品種花粉量少，因此不適合作雜交父本。

2.2 花粉貯藏力比較

試驗分別對琉球紅、大鴛鴦錦、胭脂蜜3個品種在室溫23 ℃、低溫4 ℃和-18 ℃條件下不同保存時間的花粉進(jìn)行生活力測定，結(jié)果見圖1。從圖1可見，隨著貯藏時間的延長，琉球紅、大鴛鴦錦、胭脂蜜3個品種在不同貯藏溫度下的花粉生活力均呈下降趨勢，尤其是在室溫23 ℃條件下3個品種的花粉生活力迅速下降，如在保存1 d時花粉生活力就快速下降，琉球紅的花粉保存6 d就降至3.73%，大鴛鴦錦和胭脂蜜的花粉也只能保存6 d左右，這樣在短期內(nèi)就喪失生活力是無法滿足雜交育種對花粉生活力要求的，說明其已經(jīng)不能用于雜交授粉。而4 ℃和-18 ℃條件下保存時間相同的花粉其生活力下降較緩慢，盡管在4 ℃和-18 ℃時各品種花粉生活力約在第五天或者第六天急劇下降至新鮮花粉生活力的50%左右，但之后下降幅度較小；并且具有雜交育種要求的花粉生活力水平，如琉球紅花粉可以保存約20 d，大鴛鴦錦和胭脂蜜的花粉可以保存約30 d，說明低溫大大延長了花粉貯藏時間，有助于保護(hù)杜鵑花的花粉生活力。綜合來看，室溫條件與低溫條件貯藏的杜鵑花花粉生活力差異極顯著（P<0.01），同一品種在4 ℃和-18 ℃低溫條件下保存的花粉其生活力差異不顯著（P>0.05）。

2.3 開花過程形態(tài)觀測

試驗于4月上中旬盛花期時觀察各品種的開花過程，當(dāng)時環(huán)境平均最高溫度為22 ℃、最低溫度是13 ℃。結(jié)果琉球紅的單花開放全程為10 d，其余3個品種的單花花期可達(dá)12 d。觀察發(fā)現(xiàn)，4個品種在開花的第一天就有花粉散出，花粉呈絮狀，花粉成熟早于柱頭?；ㄖα⒖蛇_(dá)10～12 d，柱頭在花蕾期（成熟前）一般為綠色（琉球紅的柱頭為殷紅色），在開花后才逐漸成熟，隨著柱頭伸長、顏色轉(zhuǎn)為黃綠色或黃白色（琉球紅的柱頭為亮紅色）后，柱頭開始分泌黏液，此時柱頭透亮，柱頭伸長到最長時有些柱頭前端會稍有彎曲，之后進(jìn)入衰老期，柱頭變?yōu)楹稚?，已?jīng)接受授粉的柱頭要比未授粉的柱頭衰老快。

4個品種在開花過程中花徑、花筒長度和花柱長度的測量結(jié)果分別見圖2、圖3、圖4、圖5。從圖2、圖3、圖4、圖5可見，隨著開花天數(shù)的增加，各品種的花柱長度均逐漸增大，至開花末期才有所減小，其中琉球紅花柱長度的最大值出現(xiàn)在花后第九天，小青蓮花柱長度在花后9～10 d最長，大鴛鴦錦和胭脂蜜的花柱長度均在花后第十天達(dá)到最長。隨著花朵的逐漸開放，琉球紅的花徑和花筒長度緩慢增大；大鴛鴦錦的花筒長度緩慢增大，花徑先逐漸增大、后又有所減小，最大值出現(xiàn)在花后8～9 d；小青蓮和胭脂蜜的花徑和花筒長度均先逐漸增大、后又有所減小，花徑均在第十天達(dá)到最大，而花筒長度最大值出現(xiàn)在第八天。

2.4 柱頭可授性評價

試驗采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性的結(jié)果見表3。由表3可知，4個品種的柱頭可授性基本一致，琉球紅單花花期平均為10 d，在開花的第四天柱頭具有可授性，隨后可授性增強，第六天至第八天可授性最強，之后隨著柱頭衰老使可授性減弱。其他3個品種的單花花期達(dá)12 d，柱頭可授性均在第五天至第九天最強。琉球紅和小青蓮在開花的第一天柱頭不具有可授性，而大鴛鴦錦和胭脂蜜在開花第一天就有部分柱頭具有可授性。結(jié)合柱頭形態(tài)發(fā)育，可授性最強的時期正是柱頭透亮并大量分泌黏液的時期，此時的授粉效果最佳。將表2與圖2、圖3、圖4、圖5對比可知，柱頭可授性開始下降的時期與花柱長度、花徑開始減小的時期基本一致。到開花末期，花瓣先于柱頭衰老，至開花的最后1 d，柱頭仍有一定的可授性，只是此時的可授性較低。

3 小結(jié)與討論

花粉活力強弱和柱頭可授性高低是植物進(jìn)行有性繁殖的基礎(chǔ)，為了進(jìn)行雜交授粉，通常需要早期采集和貯藏花粉，以解決花期不一致和遠(yuǎn)距離雜交等問題，而花粉生活力直接關(guān)系到育種的效率，因而需要進(jìn)行花粉生活力測定?；ǚ凵盍y定的方法有很多，離體萌發(fā)法是較為準(zhǔn)確可靠的一種方法，已在多種植物花粉萌發(fā)中廣為應(yīng)用[9-11]。常用的培養(yǎng)基基本成分是蔗糖和硼酸，蔗糖的作用是提供合適的滲透壓和花粉管形成所需要的營養(yǎng)與能量，硼在花粉萌發(fā)中的主要作用是可以增加糖的吸收、運轉(zhuǎn)和代謝，促進(jìn)構(gòu)成花粉管壁的成分果膠物質(zhì)的合成[12]。試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，確定適宜測定這4種東鵑品種的液體培養(yǎng)基為300 mg/L Ca（NO3）2 ·4H2O+200 mg/L MgSO4·7H2O+100 mg/L KNO3+100 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3，培養(yǎng)時間以17 h為宜。4種杜鵑花的新鮮花粉萌發(fā)力依次為：大鴛鴦錦>胭脂蜜>琉球紅>小青蓮，小青蓮由于花粉量少、且新鮮花粉的生活力也不強，不適合作為雜交父本提供花粉，故后續(xù)的花粉貯藏力研究中沒有對小青蓮的花粉進(jìn)行研究。

杜鵑花的花粉萌發(fā)率與貯藏溫度和貯藏時間的關(guān)系很密切，隨貯藏時間的延長，花粉萌發(fā)率呈下降趨勢，且不同品種花粉的貯藏力也不同。環(huán)境在4 ℃和-18 ℃的低溫對杜鵑花花粉保存較常溫下要好，可大大延長杜鵑花花粉的壽命，但2種低溫下短期內(nèi)貯藏?zé)o顯著差異。前人有研究[13]認(rèn)為，-18 ℃比4 ℃保存效果好，可能是杜鵑花花粉有一定的含水量，-18 ℃時花粉細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰對其保護(hù)酶活性產(chǎn)生了一定影響所至。此外，也有學(xué)者提出杜鵑花的花粉貯藏力與花粉剝離的方式有關(guān)，如李玉萍等[3]報道，在低溫條件下取僅去掉花瓣的花朵進(jìn)行保存效果較好，其原因可能是花絲與花柄在低溫條件下可以提供營養(yǎng)給花藥中的花粉，從而延緩了花粉的衰亡，進(jìn)而延長了花粉的貯藏時間。本試驗是取花藥保存，未對其他花粉剝離方式進(jìn)行比較研究。

試驗結(jié)果顯示，大鴛鴦錦和胭脂蜜花粉在低溫貯藏30 d后仍有一定的生活力，是較好的雜交父本材料。琉球紅花粉在低溫貯存30 d后生活力降到5%以下，不能用作父本進(jìn)行授粉。

4個杜鵑花品種單朵花開放的時間平均可持續(xù)10～12 d，其中琉球紅在花后的6～8 d柱頭可授性最強，其他3個品種均在花后的5～9 d柱頭可授性最強，此時柱頭透明并大量分泌黏液，是授粉的最佳時期。之后柱頭可授性開始下降，這與花柱長度、花徑開始減小的時期基本一致。試驗中還發(fā)現(xiàn)有少量柱頭開裂呈扁平狀的畸形變異，不過當(dāng)取不同開花天數(shù)的柱頭用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測后，發(fā)現(xiàn)其可授性變化與正常形態(tài)的柱頭可授性較一致；由此可知，其形態(tài)雖然發(fā)生了變異，但是仍然具有可授性，其可授性強弱只與其發(fā)育時期有關(guān)，相同發(fā)育時期的畸形變異柱頭與正常形態(tài)的柱頭可授性是相同的，至于畸形柱頭經(jīng)過授粉后能否正常坐果則需要通過進(jìn)一步的雜交試驗、統(tǒng)計結(jié)實率來判斷。

試驗對4種東鵑品種花粉生活力和柱頭可授性進(jìn)行了比較研究，據(jù)此了解不同東鵑品種花粉的特性，為杜鵑花雜交選擇父本材料和最佳授粉時期確定提供了依據(jù)。參試的4個品種均為武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所前期篩選出的耐熱型東鵑杜鵑花品種，這為培育耐熱、觀賞俱佳的杜鵑花混合類型雜交新品種提供了可能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林 斌.中國杜鵑花——園藝品種及應(yīng)用[M].北京：中國林業(yè)出版社，2008.

[2] 周 媛，郭彩霞，童 俊，等.杜鵑種質(zhì)綜合評價AHP模型的建立及應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（13）：3099-3102.

[3] 李玉萍，陳 堃，王燕青，等.測定杜鵑花花粉萌發(fā)力的液體培養(yǎng)基和貯藏方法研究[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報，2012，28（3）：56-61.

[4] 李國樹，徐成東，李天星，等.幾種杜鵑花花粉生活力研究[J]，北方園藝，2010（22）： 80-83.

[5] WIDRLECHNER M P， PELLETT H M， ASCHER P D， et al. In vivo pollen germination and vital staining in deciduous azaleas[J].HortScience，1983，18： 86-88.

[6] 張超儀，耿興敏.六種杜鵑花屬植物花粉活力測定方法的比較研究[J].植物科學(xué)學(xué)報，2012，30（1）：92-99.

[7] 孫 穎，馬翠青，嚴(yán)俊鑫，等.大花百子蓮的花粉活力與柱頭可授性[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，41（7）：89-92.

[8] 許 林，陳法志，戢小梅，等.紫珠屬2種植物的花粉生活力及柱頭可授性研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，34（4）：26-30.

[9] 許 林，杜克兵，陳法志，等.川鄂連蕊茶花粉的形態(tài)、生活力及貯藏力研究[J].園藝學(xué)報，2010，37（11）：1857-1862.

[10] 謝焰鋒，許 林，戢小梅，等.茶花花粉生活力及貯藏力的研究[J].北方園藝，2013（2）：74-77.

[11] 穆金艷，杜曉華，賈文慶，等.大花三色堇花粉生活力測定及貯藏方法[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，22（9）：158-162.

[12] 潘瑞熾.植物生理學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2001.

[13] 戚行江，任海英，梁森苗，等.貯藏溫度和時間對楊梅和蠟楊梅花粉萌發(fā)率及保護(hù)酶活性的影響[J].果樹學(xué)報，2014，31（3）：460-467.