滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)篩選及離體培養(yǎng)條件優(yōu)選研究

趙志蓮等

摘要：以大理州不同居群滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）、同一居群不同植株為試驗材料，采用高效液相色譜法（HPLC）對滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷的含量進(jìn)行測定；再以龍膽苦苷含量≥7.0 %的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源為外植體，采用正交試驗設(shè)計方法研究培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH及培養(yǎng)溫度對滇龍膽離體培養(yǎng)植株再生的影響。結(jié)果表明，大理州6個居群滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量較高，不同居群間龍膽苦苷含量具有顯著差異（P<0.05），以鶴慶縣居群的龍膽苦苷含量最高（80.70 mg/g），含量最低的巍山縣居群也超過國家藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的2倍多；同一居群內(nèi)不同植株滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量差異較小，只有云龍縣居群不同植株間具有顯著差異（P<0.05），其他居群不同植株間無顯著差異（P>0.05）；滇龍膽生長點離體培養(yǎng)及植株再生最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是1/2MS+30 g/L蔗糖+pH 5.2+20 ℃/25 ℃變溫培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo)率最高可達(dá)88.9%，試驗初步建立了滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生體系。

關(guān)鍵詞：滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）；種質(zhì)資源；龍膽苦苷；離體培養(yǎng)；植株再生

中圖分類號：S567.23+9；S502.4；Q946.83 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4228-04

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）是龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬[Gentiana（Tourn.）L.]多年生草本植物，別名堅龍膽、龍膽草、蘭花根、青魚膽等，主要分布在云南、貴州、四川等省[1]，為國家重點保護(hù)三級野生藥材瀕危物種。滇龍膽是傳統(tǒng)中藥龍膽的重要基源植物，以根及根莖入藥，具有清熱瀉火、保肝健脾、消炎殺菌等作用[2]。最新藥理學(xué)研究表明，滇龍膽還具有抗呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）、降血糖等功效[3，4]。

研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，滇龍膽根及根莖中主要活性成分龍膽苦苷的含量因產(chǎn)地不同而存在較大的差異，云南省不同產(chǎn)地的滇龍膽其根及根莖中龍膽苦苷的含量在2.75%～4.87%，全省滇龍膽的龍膽苦苷含量平均為4.77%；其中大理白族自治州的洱源、巍山、劍川縣所產(chǎn)滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷的含量分別為7.02%、6.02%、5.35%，顯著高于尋甸縣所產(chǎn)滇龍膽的龍膽苦苷含量（3.85%）以及昆明市所產(chǎn)滇龍膽的龍膽苦苷含量（2.45%）。由此可見，大理州所產(chǎn)滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于《中國藥典》中1.5%[8]的限量標(biāo)準(zhǔn)，所以有必要以根及根莖中龍膽苦苷含量為標(biāo)準(zhǔn)對大理州滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，并建立滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源離體培養(yǎng)及植株再生體系。為此，試驗采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）對大理州范圍內(nèi)所產(chǎn)滇龍膽野生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，再以活性成分龍膽苦苷含量較高的野生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源為外植體，在植物組織培養(yǎng)基中不添加任何植物激素的條件下，采用正交試驗設(shè)計方法研究培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH及培養(yǎng)溫度對滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的影響，以期為滇龍膽野生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源篩選、離體保存、快速繁殖、資源可持續(xù)利用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣點選擇與樣品采集 2011年9～11月，分別在云南省大理州的大理市、劍川縣、鶴慶縣、巍山彝族回族自治縣、云龍縣、洱源縣等滇龍膽的主要原料來源地采集野生居群單株，各居群間距離100 km，株距不小于3 m，6個居群各隨機(jī)采集30株，自然干燥。滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生外植體為大理市居群12～2月分化的休眠芽生長點。

1.1.2 儀器與試劑 儀器主要有美國惠普公司Agilent1100高效液相色譜儀（包括G1313A ALS自動進(jìn)樣器、G1315A/B DAD 檢測器、Agilent ChemStation色譜工作站）、梅特勒-托利多AE240分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司]、SK5200H型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、FY135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、Millipore純水處理系統(tǒng)[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）以及人工智能氣候箱；高壓滅菌器；無菌操作臺等。試劑主要有中國藥品生物制品檢定所提供的龍膽苦苷對照品（批號：110770-200510），高效液相用甲醇為色譜純，高效液相用水為三重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.1.3 樣品的選擇 在滇龍膽不同居群根及根莖中龍膽苦苷含量測定時，從每個居群中隨機(jī)選取根及根莖質(zhì)量為6.0～6.6 g的植株9株混合后作為樣品。在滇龍膽同一居群不同植株根及根莖中龍膽苦苷含量測定時，以龍膽苦苷含量較高的4個居群為研究對象，從每個居群中隨機(jī)選取根及根莖質(zhì)量為6.0～6.6 g的植株5株作為樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品中龍膽苦苷含量測定 所有樣品經(jīng)過粉碎、過100目篩、混合均勻，按照前期建立的方法[9]提取與測定龍膽苦苷的含量，每個樣品重復(fù)測定3次。龍膽苦苷含量用龍膽苦苷質(zhì)量/干物質(zhì)質(zhì)量表示。

1.2.2 滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生 滇龍膽外植體處理及接種方法按照前期建立的方法[9]完成。采用L9（34）正交試驗方法設(shè)計因子水平，分別設(shè)培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH和培養(yǎng)溫度4個因子，每個因子取3個水平，基本培養(yǎng)基為MS（含瓊脂8 g/L），各因子水平組合見表1。培養(yǎng)容器為250 mL玻璃三角瓶，每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，120 ℃高壓滅菌15 min，冷卻后每瓶接種6個外植體，每個處理接種5瓶，設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度按試驗設(shè)計進(jìn)行設(shè)置，光照度為27 μmol/（m2·s），光照時間為16 h/d。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計出芽數(shù)（接種外植體中有芽生成的外植體數(shù)），計算誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率為出芽數(shù)占接種外植體數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)表述為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽居群間及居群內(nèi)植株根及根莖中龍膽苦苷含量比較

2.1.1 不同居群的根及根莖中龍膽苦苷含量 試驗測定得到的龍膽苦苷對照品及試驗樣品的色譜圖見圖1，不同居群的根及根莖中龍膽苦苷含量情況見表2。在對大理州6個不同居群滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量的比較分析后發(fā)現(xiàn)，大理州所產(chǎn)滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量整體較高，均高于《中國藥典》中1.5%[8]的限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，含量較低的巍山縣居群和劍川縣居群就分別達(dá)到了42.87、57.33 mg/g，而鶴慶縣居群滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量高達(dá)80.70 mg/g，顯著高于其他5個居群（P<0.05）；大理市、云龍縣、洱源縣3個居群之間滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量（分別為73.30、72.27、72.40 mg/g）差異不顯著（P>0.05），但也顯著高于巍山縣居群和劍川縣居群（P<0.05）。研究結(jié)果表明，大理州的6個野生滇龍膽居群之間根及根莖中龍膽苦苷含量具有差異分化，在野生滇龍膽中存在龍膽苦苷含量較高的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，這為從野生滇龍膽居群中篩選根及根莖中龍膽苦苷含量較高的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供了依據(jù)。

2.1.2 同一居群不同植株的根及根莖中龍膽苦苷含量 大理州野生滇龍膽在大理市、洱源縣、鶴慶縣、云龍縣4個居群內(nèi)不同植株的根及根莖中龍膽苦苷含量測定結(jié)果見表3。對表3數(shù)據(jù)比較分析可知，大理市、洱源縣、鶴慶縣3個居群內(nèi)植株之間的滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量差異不顯著（P>0.05），僅云龍縣居群的植株間龍膽苦苷含量存在顯著差異（P<0.05），說明滇龍膽同一居群內(nèi)各植株的根及根莖中龍膽苦苷含量具有較穩(wěn)定的居群遺傳能力，可以把從野生滇龍膽居群中篩選出的根及根莖中龍膽苦苷含量較高的優(yōu)勢居群作為繁殖及育種材料使用。

2.2 滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的結(jié)果

2.2.1 L9（34）正交試驗設(shè)計因素對滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的影響 試驗設(shè)計的L9（34）正交試驗結(jié)果見表4。從表4可見，當(dāng)試驗因素水平組合為MS培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L+pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃時，滇龍膽離體培養(yǎng)接種外植體芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了84.4%。對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率進(jìn)行L9（34）正交試驗結(jié)果分析可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH是滇龍膽離體培養(yǎng)誘導(dǎo)芽的主要影響因素，對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率的影響較大，而培養(yǎng)基類別和蔗糖濃度對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率的影響較小。綜合各因子分析結(jié)果，得出滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的最佳組合是A2B3C1D3，即培養(yǎng)基類別為 1/2 MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+ pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃；用此組合方法對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)進(jìn)行了驗證試驗，結(jié)果芽誘導(dǎo)率達(dá)到了88.9%，與試驗結(jié)果相近，證明L9（34）正交試驗所得結(jié)果具備客觀有效性，可以作為滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)方法。

2.2.2 方差分析 為了進(jìn)一步了解試驗設(shè)計的各因子之間在滇龍膽離體培養(yǎng)促進(jìn)效果方面的差異，又對試驗結(jié)果芽誘導(dǎo)率進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，因子D（培養(yǎng)溫度）對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率產(chǎn)生的作用達(dá)到了極顯著差異水平（P<0.01），因子C（pH）對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率的作用達(dá)到了顯著差異水平（P<0.05），而因子A（培養(yǎng)基種類）和因子B（蔗糖濃度）對滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)的作用不顯著（P>0.05）。綜合各因子的表現(xiàn)，得出滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的最佳組合是A2B3C1D3，即培養(yǎng)基種類為1/2MS+蔗糖濃度30 g/L+pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃。

3 討論

試驗結(jié)果表明，大理州范圍內(nèi)滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量整體較高，滇龍膽不同居群間龍膽苦苷含量具有顯著差異（P<0.05），其中，鶴慶縣居群龍膽苦苷含量顯著高于其他居群，含量最低的巍山縣居群中龍膽苦苷含量也是《中國藥典》2010年版1.5%[8]限量標(biāo)準(zhǔn)的2倍多。滇龍膽同一居群不同植株根及根莖中龍膽苦苷含量差異較小，大理市、洱源縣、鶴慶縣3個居群內(nèi)不同植株間龍膽苦苷含量差異不顯著（P>0.05），云龍縣居群內(nèi)不同植株間龍膽苦苷含量具有顯著差異（P<0.05），說明滇龍膽同一居群內(nèi)不同植株根及根莖中龍膽苦苷含量具有較穩(wěn)定的居群遺傳能力，這個研究結(jié)果與楊維澤等[10]的研究結(jié)果相似，滇龍膽居群間表型變異高于居群內(nèi)的表型變異。證明大理州范圍內(nèi)存在龍膽苦苷含量較高的野生滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，野生滇龍膽居群間龍膽苦苷含量差異較大，居群內(nèi)龍膽苦苷含量差異較小。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是開展珍稀瀕危藥用植物資源保護(hù)、離體培養(yǎng)及植株再生研究的有效途徑。試驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中不添加任何植物激素的條件下，不同組合的培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH及培養(yǎng)溫度處理均能誘導(dǎo)滇龍膽莖尖生長點再生植株，優(yōu)選出滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的最佳培養(yǎng)組合條件是培養(yǎng)基種類為1/2MS+蔗糖濃度30 g/L+pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃。而朱宏濤等[11]、羅春梅等[12]及張潔等[13]的研究都在培養(yǎng)基中添加了植物生長調(diào)節(jié)劑，滇龍膽外植體經(jīng)過愈傷組織途徑后再完成植株再生，與本研究的植株再生方式不一樣。因此，滇龍膽離體培養(yǎng)再生植株根及根莖中龍膽苦苷含量較高的性狀是否能夠得到穩(wěn)定遺傳？同時本研究僅建立了大理州滇龍膽居群離體培養(yǎng)及植株再生體系，在此培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下是否能建立其他居群的離體培養(yǎng)及植株再生體系等，都還需要經(jīng)過下一步的試驗研究來證實。

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