橡膠鏈格孢葉斑病病原菌生物學(xué)特性研究

劉一賢等

摘要：對由橡膠鏈格孢（Alternaria heveae）引起的橡膠葉斑病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，菌絲最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH為7～8，致死溫度為52 ℃處理10 min；該病原菌能有效利用多種碳源和氮源，碳源以乳糖和鼠李糖利用率最高，牛肉浸膏和酵母浸膏為最適氮源；不同的光照條件對菌絲生長有影響，在24 h光照條件下更有利于菌絲生長。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；Alternaria heveae；生物學(xué)特性

中圖分類號： S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4195-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.022

天然橡膠和鋼鐵、煤炭、石油并稱為四大工業(yè)原料，并且是其中惟一的可再生資源。天然橡膠的用途十分廣泛，尤其是對于重要工業(yè)領(lǐng)域如航天航空、重型汽車制造等行業(yè)，天然橡膠仍屬于不可替代性資源。斯里蘭卡曾報道了超過60種侵染橡膠的病原菌[1]。鏈格孢屬（Alternaria Nees）是經(jīng)濟(jì)上重要的真菌屬之一。大多數(shù)種類兼性寄生于植物上，引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害，造成田間和產(chǎn)后損失[2]。有的小孢子種鏈格孢能感染人和動物引起皮癬等疾病[3，4]。1947年在墨西哥首次報道了由鏈格孢屬（Alternaria sp.）引起的橡膠葉斑病[5]。2006年在印度報道了由A. alternata引起的橡膠葉斑病，并采用RAPD和RFLP 2種方法分析了26株A. alternata之間的遺傳差異[6]。2013年本研究小組在云南河口植膠區(qū)發(fā)現(xiàn)一種新的橡膠葉受害癥狀，受害葉片上有許多黑色、圓形、點(diǎn)狀病斑，病斑直徑為0.1～0.4 mm，稍凹陷，病斑周圍有一黃色暈圈。與尖孢炭疽菌引起的癥狀很相似，但尖孢炭疽菌為害橡膠葉后在受害葉下形成點(diǎn)狀的突起。經(jīng)形態(tài)和分子鑒定該病病原為橡膠鏈格孢（A. heveae），為我國橡膠樹一種新病害[7]。在對云南墾區(qū)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)多個植膠區(qū)均有該病原菌引起的橡膠葉斑病，已造成一定面積的危害，對橡膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展形成潛在威脅。因此對于橡膠鏈格孢葉斑病菌生物學(xué)特性的研究對指導(dǎo)該病害的防治至關(guān)重要。

迄今，國內(nèi)還沒有對橡膠鏈格孢引起的橡膠葉斑病的相關(guān)研究報道，對病原菌生物學(xué)特性的研究還處于空白。本研究對橡膠鏈格孢生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為該病害的進(jìn)一步深入研究及防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：橡膠樹鏈格孢葉斑病菌采自云南省河口熱帶作物科學(xué)研究所苗圃，由云南省熱帶作物科學(xué)研究所分離、鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，去離子水 1 000 mL）；Czapek 培養(yǎng)基（NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖20 g）

1.2 方法

1.2.1 溫度對菌絲生長的影響 將病原菌菌株接種到PDA平板上進(jìn)行活化，培養(yǎng)3～4 d后，用直徑為5 mm 的打孔器在病原菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于10、15、20、22、24、26、28、30、35、40 ℃共10個溫度下培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d后， 用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 pH對菌絲生長的影響 將冷卻至60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液分別調(diào)節(jié)pH為3、4、5、6、7、8、9，制成PDA平板，用直徑為5 mm 的打孔器在病原菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到不同pH的平板上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 病原菌菌絲的致死溫度 將病原菌菌株接種到PDA平板上進(jìn)行活化，培養(yǎng)3～4 d后，在菌落表面滴加2 mL無菌水，用無菌棉棒將菌落表面菌絲磨碎，取菌液置于已滅菌的玻璃試管中。于40、45、50、52、54、56、58、60、65 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min，分別取0.2 mL不同溫度處理的菌液涂板于PDA平板培養(yǎng)基上，以一支在室溫中放置的試管作為對照，每個處理重復(fù)3次，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長情況。

1.2.4 碳源對菌絲生長的影響 以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、甘油、木糖等11種作為碳源，代替Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，配制不同碳源培養(yǎng)基，用直徑為5 mm 的打孔器在病原菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到不同碳源的培養(yǎng)基平板上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 氮源對菌絲生長的影響 以L-天門冬酰胺、色氨酸、胱氨酸、L-丙氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、酵母浸膏、牛肉浸膏、尿素、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、亞硝酸鈉等14種作為氮源，代替Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基，用直徑為5 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到不同氮源的培養(yǎng)基平板上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 光照對病原菌生長的影響 設(shè)置24 h黑暗、24 h光照（日光燈15 W）、12 h黑暗/12 h光照（日光燈15 W），24 h黑光燈（黑光燈15 W），4種光照條件。將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于4種光照條件下，每個處理重復(fù)3次，觀察菌落生長情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SAS9.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 溫度對菌絲生長的影響 由圖1可看出，病原菌在10～40 ℃之間都能生長，適宜溫度范圍為24～30 ℃，培養(yǎng)5 d后菌落直徑在5.05～7.32 cm之間，最適溫度為30 ℃，培養(yǎng)5 d后菌落直徑達(dá)到7.32 cm。病原菌菌絲在超過30 ℃時對溫度比較敏感，低于10 ℃或高于40 ℃時菌絲停止生長。

2.2.2 pH對菌絲生長的影響 病原菌菌絲在pH3～9時均能生長，在pH5～9均有較好長勢，最適pH為7～8，培養(yǎng)5 d后菌落直徑達(dá)到5.90 cm。病原菌菌絲對酸堿的適宜范圍比較廣，但更適宜在弱堿性環(huán)境下生長，強(qiáng)酸性環(huán)境明顯抑制菌絲生長（圖2）。

2.2.3 病原菌菌絲的致死溫度 以在室溫下處理作為對照，設(shè)置了9個溫度對病原菌菌絲進(jìn)行處理，在40、45、50 ℃處理下菌絲均能形成新菌落，在52 ℃處理下不能形成新菌落，說明病原菌菌絲的致死溫度為52 ℃處理10 min（表1）。

2.2.4 不同碳源對菌絲生長的影響 對11種不同碳源進(jìn)行比較之后發(fā)現(xiàn)病原菌對乳糖和鼠李糖利用最好，菌絲生長較快，培養(yǎng)5 d后菌落直徑達(dá)到5.83 cm和5.63 cm。其次是對可溶性淀粉利用較好，菌落直徑為5.30 cm，在含有葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、甘油的培養(yǎng)基上病原菌長勢較慢，菌落直徑為3.4～3.7 cm（圖3）。

2.2.5 不同氮源對菌絲生長的影響 由圖4可知，在含有14種不同氮源的培養(yǎng)基上，病原菌在含牛肉浸膏和酵母浸膏的培養(yǎng)基上長勢最快，對氮源的利用率最高，培養(yǎng)5 d后菌落直徑分別達(dá)到5.17 cm和5.57 cm。在含L-天門冬酰胺、甘氨酸、NaNO3、L-丙氨酸、NH4Cl、色氨酸的培養(yǎng)基上病原菌長勢明顯減弱，菌落直徑無顯著性差異。尿素、酪氨酸、L-精氨酸、胱氨酸對病原菌有明顯的抑制作用，菌落直徑僅為0.8～1.8 cm。說明病原菌對有機(jī)氮源和無機(jī)氮源都能利用，但對有機(jī)氮源的利用率更高。

2.1.6 光照對病原菌生長的影響 設(shè)置了4種光照條件對病原菌進(jìn)行處理（表2），在24 h光照條件下更有利于菌絲生長，并且在光照條件下有利于產(chǎn)生色素。在光暗交替的條件下更有利于孢子產(chǎn)生，光暗交替和黑光照射對菌絲的影響無明顯差異，黑暗條件下不利于菌絲生長。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)本研究結(jié)果可知，橡膠樹鏈格孢菌在10～40 ℃之間均能生長，最適生長溫度為30 ℃，橡膠鏈格孢菌在超過35 ℃高溫下亦可生長，這與橡膠樹生長氣候條件相符。小麥鏈格孢（A. triticina）菌落生長的溫度范圍為5～35 ℃，說明不同種的鏈格孢生長的溫度范圍有所差異，與田間發(fā)病情況有關(guān)[8]。橡膠鏈格孢對酸堿的適應(yīng)范圍比較廣，菌絲在pH3～9范圍內(nèi)均能生長，而煙草赤星病菌（A. alternata）在pH低于4的環(huán)境下不能生長，小麥鏈格孢在pH低于3.5的環(huán)境下不能生長，說明橡膠鏈格孢對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗逆性[8，9]。菌絲在52 ℃條件下處理10 min停止生長，其菌絲致死溫度略高于其他種的鏈格孢，這是由于其對高溫的適應(yīng)能力更強(qiáng)。對于橡膠鏈格孢的防治，可以根據(jù)田間的氣候特點(diǎn)、溫度、濕度、土壤酸堿度等特征掌握其發(fā)生流行的規(guī)律，從而更好的防治該病害。

通過對11種不同碳源進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，病原菌對乳糖和鼠李糖利用最好，對14種氮源比較發(fā)現(xiàn)，病原菌在含牛肉浸膏和酵母浸膏的培養(yǎng)基上長勢最好，對氮源的利用率最高。不同種的鏈格孢對碳源和氮源的利用各不相同，席興文等[10]提出不同種鏈格孢對碳源、氮源的利用及培養(yǎng)特征可作為分類鑒定的依據(jù)。而對于橡膠鏈格孢的防治可采用其利用效率較低的碳源、氮源開發(fā)新農(nóng)藥。

鏈格孢屬真菌是引起植物病害的重要真菌類群之一，廣泛寄生于農(nóng)作物上引起病害[11]。該類真菌引起作物發(fā)病的機(jī)制主要是由其代謝產(chǎn)生的毒素導(dǎo)致的[12，13]。近年來國內(nèi)外利用微生物制劑、植物源制劑及誘抗劑等對鏈格孢屬真菌引起的植物病害進(jìn)行生物防治，取得了一定的效果。例如日本研發(fā)的多氧霉素和我國研發(fā)的多抗霉素對煙草赤星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病具有顯著的效果。王東昌等[14]從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中提取的一種抗菌素對鏈格孢引起的蘋果霉心病菌也具有良好的抑菌效果。因此，對于橡膠鏈格孢葉斑病的防治在采取傳統(tǒng)化學(xué)藥劑防治的同時，可積極研發(fā)有效的微生物制劑、農(nóng)用抗生素等新型農(nóng)藥。

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