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    煙曲霉YSITB I菌株篩選及其降解木質(zhì)纖維中木質(zhì)素研究

    2015-10-09 21:38:04袁俊超等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年17期
    關(guān)鍵詞:木質(zhì)素溫度

    袁俊超等

    摘要:天牛幼蟲腸道菌群具有分解木質(zhì)纖維的功能。本研究以木質(zhì)纖維為唯一碳源,從天牛幼蟲腸道中篩選出三株對(duì)木纖維具有降解能力的菌株,對(duì)其中的煙曲霉YSITB I菌株降解木纖維中木質(zhì)素能力及降解條件進(jìn)行研究,并對(duì)三種菌株降解木纖維中木質(zhì)素的協(xié)同作用進(jìn)行了初步觀察。結(jié)果顯示,煙曲霉YSITB I菌株具有較好的木質(zhì)素降解作用,在30 ℃、pH值6.8條件下,對(duì)構(gòu)樹木質(zhì)纖維中木質(zhì)素的降解率可達(dá)56.9%;枯草芽孢桿菌YSITBII和煙曲霉YSITB I協(xié)同作用可提高木質(zhì)素降解效率至64.8%;煙曲霉YSITB I 15d降解木纖維效率高于40%。煙曲霉對(duì)木質(zhì)纖維的降解作用達(dá)到甚至高于模式菌-黃包原毛平革菌,降解木纖維程度較高,用于木質(zhì)纖維脫木質(zhì)素或秸稈降解漚肥具有很好的應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞:木質(zhì)素;天牛幼蟲;pH;溫度;協(xié)同性;煙曲霉菌;漚肥

    中圖分類號(hào):S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)17-4164-04

    天牛成蟲在樹木表皮上蛀槽或鉆洞產(chǎn)卵,卵孵化出幼蟲后即蛀入樹干,最初在樹皮下取食,待齡期增大后,即鉆入木質(zhì)部,在樹干內(nèi)越冬,通常可在樹干內(nèi)生活3~4個(gè)月甚至1~2年,以蛀食木質(zhì)部為生。其消化腸道是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),棲息著大量的微生物。這些微生物對(duì)宿主起著非常重要的作用,其中某些種類可能具有分解木質(zhì)纖維中的木質(zhì)素的能力[1-3]。本項(xiàng)目擬從天牛幼蟲腸道菌群中分離篩選具木質(zhì)素降解功能的菌株,探討其降解木質(zhì)素作用條件、降解效率以及影響因素,用于木質(zhì)纖維的再利用脫木質(zhì)素或廢棄木材和秸稈等的降解[4,5]。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料 天牛幼蟲:2014年3月采自湖北咸寧蔡家?guī)X林場(chǎng)楊樹樹干。煙曲霉(Aspergillus fumigatus)YSITB I菌株、枯草芽孢桿菌YSITB Ⅱ菌株、蠟樣芽孢桿菌YSITB Ⅲ菌株,由本試驗(yàn)分離篩選自天牛幼蟲腸道。黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(CICC14076),由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存中心提供。木纖維是構(gòu)樹根提取黃酮后的殘?jiān)?,脫脂脫蛋白,低溫烘干,粉碎,淺黃色粉末。

    1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。木纖維液體培養(yǎng)基:構(gòu)樹木纖維0.500 0 g,KH2PO4 0.215 0 g,(NH4)2SO4 0.216 0 g,MgSO4 0.007 3 g,CaCl2 0.015 0 g,加去離子水溶解至50 mL。木纖維固體培養(yǎng)基:在木纖維液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入4.5 g瓊脂,加熱融化。每種培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

    1.1.3 主要試劑和儀器 木質(zhì)素(GR荷蘭DUCHEFA公司)、蒽酮(AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、溴乙酰(AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)有限公司UV759),倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71)

    1.2 方法

    1.2.1 菌株的分離、純化及篩選 取天牛幼蟲一條,以75%的乙醇清洗,顯微鏡下取出腸道,加2 mL無(wú)菌水勻漿,梯度稀釋至10-8,分別取10-6、10-7、10-8三個(gè)梯度勻漿懸液200 μL涂布于木纖維固體培養(yǎng)基上,每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次。37 ℃培養(yǎng),隔天觀察。取各種不同單菌落再涂布于木纖維固體培養(yǎng)基上,在同樣條件下進(jìn)行2次純化培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng),觀察各菌落對(duì)木質(zhì)纖維的降解作用。

    1.2.2 菌株形態(tài)觀察及鑒定 對(duì)生長(zhǎng)較好的3種主要菌株進(jìn)行菌落、菌絲及菌細(xì)胞觀察,真菌做ITS序列鑒定,細(xì)菌做16S序列鑒定。

    1.2.3 煙曲霉YSITB I菌株降解木纖維觀察 選取其中生長(zhǎng)較好的1種菌株(編號(hào)為YSITB I,經(jīng)鑒定為煙曲霉)作進(jìn)一步降解木纖維作用觀察。取直徑約5 mm 煙曲霉YSITB I菌落1個(gè),加2 mL滅菌水充分震蕩制成菌懸浮液。每30 mL木纖維液體培養(yǎng)基中接入200 μL菌懸液,橡膠塞塞緊,設(shè)為試驗(yàn)組。另取30 mL木纖維液體培養(yǎng)基,接入200 μL無(wú)菌水,作為空白對(duì)照組,每組平行接種3瓶,在恒溫空氣搖床30 ℃、100 r/min下培養(yǎng)。觀察記錄菌落生長(zhǎng)及木纖維降解情況。

    1.2.4 煙曲霉YSITB I菌株降解木質(zhì)素條件選擇 溫度按1.2.3中試驗(yàn)方法和用量接種煙曲霉YSITB I,分別在10 ℃(室外)、15 ℃(室內(nèi))、30 ℃、40 ℃、50 ℃共5個(gè)溫度條件下培養(yǎng),每隔3 d取出200 μL培養(yǎng)液,用硫酸-蒽酮法[6]檢測(cè)溶液還原糖含量,共觀察15 d。最后,培養(yǎng)液過(guò)濾、洗滌、烘干,得木纖維殘?jiān)Q重,用溴乙酰法[7-9]測(cè)量木質(zhì)素含量。以黃孢原毛平革菌作對(duì)照進(jìn)行同樣的培養(yǎng)和處理。按下式計(jì)算木質(zhì)素降解率。

    木質(zhì)素降解率=殘?jiān)心举|(zhì)素總量/原料中木質(zhì)素總量×100%

    天牛幼蟲腸道液pH約6.5,觀察不同pH對(duì)煙曲霉降解木質(zhì)素的影響。以NaH2PO4-Na2HPO4緩沖系配制木纖維液體培養(yǎng)基,pH分別調(diào)為5.9、6.2、6.5、6.8、7.1,按1.2.3中試驗(yàn)方法和用量接種煙曲霉YSITB I,按以上取樣方法進(jìn)行檢測(cè)。以黃孢原毛平革菌作對(duì)照進(jìn)行同樣的培養(yǎng)和處理。

    1.2.5 煙曲霉YSITB I菌株與兩種細(xì)菌菌株的協(xié)同降解木質(zhì)素作用 將煙曲霉YSITB I與枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌按下述方式組合,接種至30 mL木纖維液體培養(yǎng)基中,按1.2.3中試驗(yàn)方法處理培養(yǎng)。按1.2.4.取樣方法進(jìn)行檢測(cè)。組合①,200 μL的煙曲霉YSITB I菌液;組合②,100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+100 μL的枯草芽孢桿菌菌液;組合③,100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+100 μl的蠟樣芽孢桿菌菌液;組合④,100 μL的煙曲霉YSITB I菌液+50 μL的枯草芽孢桿菌菌液+50 μL的蠟樣芽孢桿菌菌液。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株篩選與鑒定

    以木纖維固體培養(yǎng)基從天牛幼蟲腸道中分離篩選出3株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株(圖1),分別為YSITB I、YSITB II和YSITB III。YSITB I:棉花樣,開始為白色,2~3 d后轉(zhuǎn)為綠色,數(shù)日后變?yōu)樯罹G色,呈粉末狀。YSITB II:圓點(diǎn)狀,乳白色,菌落大小不一,向上凸起。YSITB III:菌落較大,不透明,表面粗糙似毛玻璃狀或蠟狀,邊緣放射狀擴(kuò)散。圖2a為菌絲在木纖維上的生長(zhǎng)情況,菌絲包裹木纖維顆粒生長(zhǎng),基部伸入纖維顆粒內(nèi)部,第二天開始出現(xiàn)孢子囊,孢子囊呈燒瓶狀,小梗單層,由多列菌絲排列成柵欄狀,頂端有鏈形分生孢子,分生孢子球形,有小棘,呈綠色,如圖2b所示。經(jīng)ITS序列鑒定,YSITB I為煙曲霉,YSITBⅡ和Ⅱ和YSITBⅢ經(jīng)16S序列鑒定,分別為枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。圖3是煙曲霉YSITB I的進(jìn)化樹。

    2.2 煙曲霉YSITB I降解木纖維觀察

    圖4a示煙曲霉YSITB I在木纖維液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)形成的菌絲團(tuán),培養(yǎng)至第二天時(shí)菌絲團(tuán)直徑可達(dá)6 cm,纖維顆粒被菌絲包裹,溶液變得澄清透明,基本見(jiàn)不到明顯的木纖維顆粒;空白木纖維培養(yǎng)基在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)明顯變化,如圖4b。

    2.3 煙曲霉YSITB I在不同條件下對(duì)木纖維的降解作用

    2.3.1 溫度的影響 由表1可知,在考察的溫度范圍內(nèi),煙曲霉YSITB I對(duì)木纖維中木質(zhì)素的降解率先隨溫度升高而增大,30 ℃時(shí)達(dá)到最大降解率45.1%,隨后隨溫度升高降解作用減小。黃孢原毛平革菌在溫度為15 ℃時(shí),木質(zhì)素的最大降解率為39.2%,煙曲霉YSITB I對(duì)木質(zhì)素的最大降解率比黃孢原毛平革菌高出5.9個(gè)百分點(diǎn)。

    對(duì)纖維素的降解作用以培養(yǎng)液中還原糖的變化表示,如圖5所示。溫度在30 ℃和40 ℃時(shí),培養(yǎng)液中還原糖的含量較低,這應(yīng)是兩種作用的共同結(jié)果,一方面菌株生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的酶降解纖維素和半纖維素等物質(zhì)使糖含量不斷升高,另一方面菌株生長(zhǎng)不斷消耗糖,其一階段糖的生產(chǎn)量高于糖的消耗量,培養(yǎng)液中糖含量不斷增加,至第九天二者達(dá)到平衡,之后隨著菌株不斷生長(zhǎng),糖消耗量超過(guò)糖的生產(chǎn)量,培養(yǎng)液中糖含量下降。50 ℃時(shí)培養(yǎng)液中還原糖含量隨時(shí)間逐漸下降,這可能提示較高溫時(shí),酶活性下降。低溫時(shí)糖含量變化沒(méi)有明顯趨勢(shì)。

    2.3.2 pH的影響 由表2可知,煙曲霉YSITB I在pH 6.8時(shí),木質(zhì)素降解率最大,達(dá)56.9%,接近黃孢原毛平革菌的最大降解率60.3%,其他pH條件下,木質(zhì)素降解效率相差不明顯。培養(yǎng)液中還原糖含量的變化如圖6所示,總體上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì),至第九天達(dá)最大值,其中pH 6.8和pH 7.1時(shí),還原糖含量較低,明顯低于其它pH條件下的含量。

    2.4 不同菌株對(duì)木質(zhì)素的協(xié)同降解作用

    由表4可知,煙曲霉YSITB I+枯草芽孢桿菌協(xié)同降解木質(zhì)素的效率達(dá)64.8%,比煙曲霉YSITB I單獨(dú)降解木質(zhì)素效率高出18.6個(gè)百分點(diǎn),也明顯高于其他兩種組合的降解率,說(shuō)明煙曲霉YSITB I與枯草芽孢桿菌組合對(duì)木質(zhì)素的降解具有一定的協(xié)同性。但這種作用需要做進(jìn)一步觀察研究。煙曲霉YSITB I+蠟樣芽孢桿菌協(xié)同降解對(duì)含菌絲體木纖維的降解率為41.0%,比煙曲霉YSITB I單獨(dú)降解木質(zhì)纖維高出1個(gè)百分點(diǎn),也明顯高于其他兩種組合的降解率。說(shuō)明煙曲霉YSITB I與蠟樣芽孢桿菌對(duì)木纖維的降解具有一定的協(xié)同性。但這種協(xié)同作用是否與應(yīng)用漚肥有關(guān),有待進(jìn)一步的研究。

    3 討論

    本試驗(yàn)篩選出的煙曲霉是天牛幼蟲腸道微生物菌群之一。煙曲霉是一種腐生真菌,是人類肺部的主要真菌病原體[10]。近來(lái),許多微生物學(xué)家和環(huán)保學(xué)家正在研究利用煙曲霉對(duì)色素的降解作用和利用煙曲霉菌絲的吸附作用[11]治理污水。霉菌能降解色素、石油等有機(jī)物污染物主要是因?yàn)榉置诘拿竅12,13]的作用。黃孢原毛平革菌是降解木質(zhì)素的模式菌,但近些年來(lái)被用作降解色素[14]。煙曲霉也含有降解色素的酶,煙曲霉曾被用作降解植物細(xì)胞壁[15],細(xì)胞壁含有豐富的木質(zhì)素[2]。綜上所述,煙曲霉能降解木質(zhì)素具有一定的依據(jù)。

    溫度和pH條件是菌種生長(zhǎng)的不可缺少的因素。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)煙曲霉木質(zhì)素降解率的測(cè)定,得出了30 ℃為煙曲霉的最適溫度,6.8 pH為最適酸堿度,符合普遍真菌的生長(zhǎng)溫度和pH值。

    4 結(jié)論

    為尋找木質(zhì)素降解菌,本研究從天牛幼蟲腸道中分離出3種可利用木纖維作碳源的菌株,其中煙曲霉YSITB I具有明顯的降解木質(zhì)素作用,在pH 6.8、溫度30 ℃條件下,對(duì)木纖維中木質(zhì)素的降解率可達(dá)56.9%。煙曲霉+枯草芽孢桿菌的協(xié)同降解木質(zhì)素作用要好于煙曲霉單獨(dú)對(duì)木質(zhì)素的降解作用,其降解木質(zhì)素效率要高出18.6個(gè)百分點(diǎn);煙曲霉YSITB I+蠟樣芽孢桿菌協(xié)同降解木纖維的效率達(dá)41.0%。通過(guò)煙曲霉和黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素兩個(gè)因素的影響下的陽(yáng)性對(duì)照,在誤差允許的范圍內(nèi),煙曲霉對(duì)木質(zhì)素的降解作用和黃孢原毛平革菌的基本持平。所以煙曲霉用于木質(zhì)纖維脫木質(zhì)素或秸稈降解漚肥具有很好的應(yīng)用前景。

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