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    F26-T菌株對(duì)水稻稻曲病生防效果的初步研究

    2015-10-09 05:26:20鄢一笑劉前剛楊習(xí)群陳海榮魏小武張德元
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:稻曲病稻曲稀釋液

    鄢一笑,劉前剛,楊習(xí)群,陳海榮,杜 宇,靳 磊,魏小武,張德元

    (湖南省微生物研究院, 湖南 長沙410009)

    近年來,湖南省水稻稻曲病發(fā)生呈逐年加重的趨勢(shì),流行性強(qiáng),危害嚴(yán)重,不僅造成大量癟粒病粒,導(dǎo)致稻谷產(chǎn)量及品質(zhì)下降,而且病粒含有毒素,這種毒素能引起人畜慢性中毒,極大的影響了糧食高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和食品安全[1]。目前,還未發(fā)現(xiàn)水稻稻曲病高抗品種,生產(chǎn)上主要依賴愛苗、萬興、好力克等化學(xué)農(nóng)藥來防治[2]。尤其是某些農(nóng)藥的毒性大、殘留高,對(duì)生態(tài)平衡和人們的健康產(chǎn)生了較大影響,成為當(dāng)前防治水稻稻曲病亟待解決的問題[3]。試驗(yàn)從易于定殖到水稻葉部的葉際微生物著手,以期篩選出水稻稻曲病的高效防治菌株,更好地發(fā)揮生防微生物的防病潛能,為最終培育出對(duì)人畜安全的優(yōu)質(zhì)水稻品種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    稻曲病病原菌從湖南長沙市郊稻田稻曲病發(fā)病植株病穗中采集提取??估F?00 μg/m L 和抗病原真菌雙標(biāo)記突變菌株——F26 菌株和F26-T 菌株,由湖南省微生物研究院植保微生物室分離及選育。供試水稻品種為華優(yōu)451,由湖南湘東種業(yè)有限公司提供。供試培養(yǎng)基有:(1)PSA 培養(yǎng)基,馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 m L;(2)PS 培養(yǎng)基,馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 m L;(3)改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基(F26 菌株活化培養(yǎng)用),可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 m L;(4)選擇抗性培養(yǎng)基(F26-T 菌株選擇性培養(yǎng)用),在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入利福平溶液,使其在培養(yǎng)基中濃度為200 μg/m L。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 F26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病菌的拮抗作用 參照程明淵等[4]的試驗(yàn)方法,將水稻稻曲病菌(橘黃色稻曲球)接種到PS 培養(yǎng)液中,5~8 d 鏡檢,待產(chǎn)生分生孢子后,將分生孢子液和冷卻至45℃的PSA 混合后倒平板,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d 后,再將供試拮抗菌株點(diǎn)接到平板,每個(gè)平板對(duì)稱點(diǎn)接兩個(gè)菌株,然后置26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5 d 后觀察并記錄結(jié)果,以平均抑菌帶寬、抑菌圈平均直徑/拮抗菌落平均直徑之比來衡量生防菌的拮抗效果。

    1.2.2 F26-T 菌株發(fā)酵濾液對(duì)稻曲病菌的抗生作用將供試拮抗菌株活化后轉(zhuǎn)接到高氏改良一號(hào)培養(yǎng)液中,置28℃,180 r/min 搖床震蕩發(fā)酵6 d,發(fā)酵液經(jīng)滅菌濾紙過濾,濾液轉(zhuǎn)移至50 m L 離心管,4℃、8 000 r/min 離心15 min,取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后備用。將稻曲病菌接種到PS 培養(yǎng)液中,待產(chǎn)生分生孢子后,將分生孢子液和冷卻至45℃的PSA 混合倒平板,待平板冷卻后,置一無菌牛津杯(內(nèi)徑0.7 cm,高0.9 cm)于平板中心,將300 μL 的F26-T 菌株發(fā)酵濾液原液、F26-T 菌株發(fā)酵濾液稀釋5 倍液和F26-T 菌株發(fā)酵濾液稀釋10 倍液分別加入到不同的牛津杯中,以5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液和無菌水為對(duì)照,置26℃恒溫箱中培養(yǎng),5 d 后觀察并記錄各處理的抑菌圈直徑。

    1.2.3 F26-T 菌株孢子懸液對(duì)水稻稻曲病的田間防效 將培養(yǎng)好的放線菌F26 用無菌水稀釋制成1.0×106cfu/m L 的孢子懸液,于水稻有穗分化期分3 次連續(xù)3 d 噴霧接種孢子懸液,以孢子懸液在水稻葉片上不下滴為宜,以5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液和無菌水為正負(fù)對(duì)照,每個(gè)處理3 次重復(fù),每個(gè)小區(qū)8 m2(2 m×4 m),各小區(qū)間隔不小于2 m,隨機(jī)排列。待水稻黃熟期,采用五點(diǎn)取樣法,每個(gè)重復(fù)調(diào)查25 叢水稻,調(diào)查指標(biāo)有總稻穗數(shù)和病稻穗數(shù),并以病穗數(shù)為單位,采用5 級(jí)分級(jí)法,計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[5]。水稻稻曲病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0 級(jí):無??;1 級(jí):每穗有1個(gè)病粒;2 級(jí):每穗有2~4個(gè)病粒;3 級(jí):每穗有5~7個(gè)病粒;4 級(jí):每穗有8~10個(gè)病粒;5 級(jí):每穗有10個(gè)病粒以上。

    1.2.4 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況 水稻種子用1%次氯酸鈉浸種消毒5 m in,用無菌水漂洗3 次,然后播種,采取常規(guī)措施對(duì)水稻進(jìn)行施肥澆灌等田間管理。將培養(yǎng)好的放線菌F26 用無菌水稀釋制成1.0×106cfu/m L 的孢子懸液,于水稻有穗分化期分3 次連續(xù)3 d 噴霧,以孢子懸液在水稻葉片上不下滴為宜。分別于第3 次噴霧接種后0、1、3、6、9、12 和15 d 采集水稻葉片,取樣時(shí)兼顧水稻植株上、中和下部葉片。利用抗性選擇培養(yǎng)基采用梯度稀釋法檢測(cè)F26-T 菌株在水稻稻葉中的數(shù)量,計(jì)算單位重量水稻葉片中F26-T菌株的定殖量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 F26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病菌的拮抗作用

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)PSA 平板對(duì)峙培養(yǎng)5 d 后,F(xiàn)26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病菌的平均抑菌帶寬為14.5 mm,其抑菌圈平均直徑與拮抗菌落平均直徑之比為5.05;而初始菌株F26 對(duì)水稻稻曲病菌的平均抑菌帶寬為14.7 mm,其抑菌圈平均直徑與拮抗菌落平均直徑之比為5.12。兩菌株的差異不明顯,表明F26-T 突變菌株和初始菌株F26 對(duì)水稻稻曲病菌具有相同的拮抗作用。

    2.2 F26-T 菌株發(fā)酵濾液對(duì)稻曲病菌的抗生作用

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,F(xiàn)26-T 發(fā)酵濾液原液的平均抑菌圈直徑為25.2 mm,明顯優(yōu)于5%井岡霉素水劑500倍稀釋液稀釋處理的平均抑菌圈直徑(20.1 mm);F26-T 發(fā)酵濾液5 倍稀釋液的平均抑菌圈直徑為20.5 mm,與5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液稀釋處理的平均抑菌圈直徑相當(dāng);稀釋10 倍的F26-T 發(fā)酵濾液平均抑菌圈直徑為17.2 mm,稍差于5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液稀釋處理;而無菌水對(duì)照處理的平均抑菌圈直徑為0 mm。

    2.3 F26-T 菌株孢子懸液對(duì)水稻稻曲病的田間防效

    從表1 中可以看出,無菌水處理的稻曲病病情指數(shù)極顯著高于其他處理;孢子懸液原液、孢子懸液5倍稀釋液和孢子懸液10 倍稀釋液對(duì)水稻稻曲病的田間相對(duì)防效分別為76.93%、66.23%和53.96%;其中,F(xiàn)26-T 菌株孢子懸液原液對(duì)水稻稻曲病的田間防效極顯著高于5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液處理;而F26-T 菌株孢子懸液5 倍稀釋液和10 倍稀釋液對(duì)水稻稻曲病的田間防效與5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液處理無顯著性差異。

    表1 F26-T 菌株孢子懸液對(duì)水稻稻曲病的田間防效

    2.4 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況

    由圖1 可知,接種后第0~1 天,F(xiàn)26-T 菌落數(shù)下降較為明顯;第1~6 天,菌落數(shù)逐漸增加,并上升至最高;第6~15 天,菌落數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定;以接種后第6天的菌落數(shù)最多,為8.54×103cfu/m L。因此,F(xiàn)26-T 菌株在水稻葉圍定殖情況為:接種后第1 天該菌株數(shù)量下降明顯,第3~6 天該菌株逐漸適應(yīng),并進(jìn)入生長繁殖期,第9~15 天該菌株在水稻葉圍的數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。

    圖1 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況

    3 結(jié)論與討論

    研究結(jié)果表明,F(xiàn)26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗和抗生作用。該菌株在水稻葉圍噴霧接種后第3~6 天就已逐漸適應(yīng)葉圍環(huán)境,進(jìn)入定殖生長階段,這是其對(duì)水稻稻曲病有生防作用的主要原因之一;其孢子懸液原液、5 倍稀釋液和10 倍稀釋液的田間相對(duì)防效分別為76.93%、66.23%和53.96%,效果較為理想。該研究為水稻稻曲病的防治提供了一條新的途徑,但該菌株的生防機(jī)制以及在其定殖點(diǎn)菌落生長和產(chǎn)素的適宜條件等還需進(jìn)一步探索。

    趙新華等[6]和Nair 等[7]分別從水稻和咖啡葉圍成功篩選出芽孢桿菌菌株,這些菌株對(duì)水稻白葉枯病菌及多種植物病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)拮抗作用。自然界中,水稻(寄主)、病原物(稻曲病病菌)、生防微生物和環(huán)境之間的關(guān)系是極為復(fù)雜的,需明確水稻葉部、穗部生防微生物與病原物及其他生物、分泌物和各種環(huán)境因子之間的相互作用及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,才能有效地調(diào)控?zé)o機(jī)與有機(jī)環(huán)境,為生防微生物創(chuàng)造適宜環(huán)境,改進(jìn)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力,以更好地發(fā)揮生防微生物的防病促生等功能。

    [1]鄒克琴,胡東維,王為民,等.水稻稻曲病的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(5):704-706.

    [2]張 舒,張求東,羅漢剛,等.水稻稻曲病的藥效試驗(yàn)和防治適期的選定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,26(2):178-181.

    [3]尹小樂,陳志誼,劉永鋒,等.稻曲病拮抗細(xì)菌的篩選與評(píng)價(jià)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,27(5):983-989.

    [4]程明淵,劉洪濤,閻萬元,等.人工培養(yǎng)條件下稻曲病菌厚垣孢子產(chǎn)生因素初探[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),1996,(2):62-64.

    [5]何明遠(yuǎn),張戰(zhàn)泓,劉建宇,等.27.12%堿式硫酸銅懸浮劑(銅高尚)防治水稻稻曲病田間藥效試驗(yàn)[J].新農(nóng)藥,2006,10(1):26-27.

    [6]趙新華,陳衛(wèi)良,李德葆,等.白葉枯病菌拮抗菌篩選及水稻葉圍微生物互作研究初報(bào)[J].中國水稻科學(xué),2000,14(3):161-164.

    [7]Nair JR,Singh G,Sekar V.Isolation and characterization of a novel Bacillus strain from coffee phyllosphere showing antifungal activity[J].JouralofAppiled Microbiology,2002,93(5):772-880.

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