姜黃揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備與驗(yàn)證及穩(wěn)定性考察

張超，韓麗，歐小群，張芳，楊秀梅，郝月莆

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖[1]，主要分布于福建、廣東、廣西、云南、四川、湖北等地。姜黃性溫而味辛、苦，具有破血行氣，通經(jīng)止痛的功效。臨床常用于胸腹脹痛、肩臂痹痛、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷等癥[2]。姜黃主要含揮發(fā)油和姜黃素類，據(jù)測(cè)定，姜黃中揮發(fā)油含量可達(dá)4.0%~6.0%，姜黃素為1.8%~5.4%。目前關(guān)于姜黃素的研究報(bào)道較多，主要集中在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血管生成等方面，而作為姜黃重要活性部位的姜黃揮發(fā)油研究很少，現(xiàn)代藥理研究表明，姜黃揮發(fā)油具有良好的抗菌、消炎、祛痰、止咳、抗癌等生物活性[3~5]，在食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

但是，揮發(fā)油作為中藥有效成分，由于極易揮發(fā)，對(duì)光和熱的不穩(wěn)定，且具有較強(qiáng)的氣味，影響了其臨床藥效的發(fā)揮和患者用藥的順應(yīng)性，因此，為了提高姜黃揮發(fā)油的穩(wěn)定性，掩蔽其不良?xì)馕?，將其制備?β-環(huán)糊精(β-CD)包合物。本試驗(yàn)采用飽和水溶法制備姜黃揮發(fā)油 β-環(huán)糊精包合物，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選最佳包合工藝，采用薄層色譜法和紫外分光光度法對(duì)包合產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行考察，為含姜黃揮發(fā)油的相關(guān)制劑的制備提供理論依據(jù)。

1 材料

85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器( 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠) ，Sar-torious BP 211D型電子天平(德國(guó)) ;UV-6100型雙光束紫外可見分光光度計(jì)( 上海美譜達(dá)儀器有限公司) ，姜黃揮發(fā)油(實(shí)驗(yàn)室自制) ；β-環(huán)糊精( 成都市科龍化工試劑廠) ；硅膠G薄層板(實(shí)驗(yàn)室自制) ；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃揮發(fā)油包合物的制備工藝研究

2.1.1 姜黃揮發(fā)油β-CD包合物的制備 采用飽和水溶液法制備[6]，精密稱取適量的 β-CD置于三角瓶中，加入適量蒸餾水，在規(guī)定溫度下加熱使溶解，配制成飽和水溶液，于設(shè)置一定轉(zhuǎn)速的磁力攪拌器上恒溫?cái)嚢?，精密量取揮發(fā)油適當(dāng)體積，按1:1用無(wú)水乙醇稀釋，配成50%（v/v)的姜黃揮發(fā)油乙醇溶液，在攪拌的同時(shí)將其緩慢滴加入含 β-CD的飽和水溶液中，恒溫?cái)嚢柚烈?guī)定時(shí)間，攪拌結(jié)束后待包合物冷卻至室溫，將形成的包合物混懸液置于冰箱冷藏24 h后，抽濾，棄去濾液，濾餅先用少量蒸餾水沖洗，再用石油醚（30~60 ℃）洗滌3次（每次10 mL），抽干后40℃減壓干燥5 h，即得包合物，稱定重量，備用。姜黃揮發(fā)油與 β-CD物理混合物的制備[7]按包合時(shí)對(duì)應(yīng)的物料比，稱定適量揮發(fā)油和β-CD，共同置于研缽中研磨混勻，即得一定顏色的粉末狀混合物。

2.1.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)[8]揮發(fā)油包合率是衡量包合效果的重要指標(biāo)，揮發(fā)油包合率越高，包合效果越好。而包合物收得率在實(shí)際生產(chǎn)中也具有重要意義，因此試驗(yàn)中綜合考慮兩指標(biāo)，采用加權(quán)綜合評(píng)分法，根據(jù)各指標(biāo)的重要性確定揮發(fā)油包合率和包合物收得率的加權(quán)系數(shù)分別為0.8、0.2，按下列公式計(jì)算揮發(fā)油包合率和包合物收得率，并進(jìn)行綜合評(píng)分，得到最佳工藝。

揮發(fā)油包合率( % ) = (包合物中實(shí)際含油量) / (揮發(fā)油加入量×空白回收率)×100%

包合物收得率( %) = 包合物實(shí)際質(zhì)量/ (β-CD質(zhì)量+揮發(fā)油加入量)×100%

綜合評(píng)分Y（%）= 揮發(fā)油包合率(%)×0.8+包合物收得率(%)×0.2

2.1.3 包合物中實(shí)際含油量測(cè)定 將制得的姜黃揮發(fā)油包合物，置于500 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水200 mL，按揮發(fā)油測(cè)定法( 2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄XD甲法)[9]進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，至油量不再增加時(shí)停止加熱，放置1 h，讀取揮發(fā)油量即可。

2.1.4 揮發(fā)油空白回收率測(cè)定[10]精密量取3份揮發(fā)油各1 mL，分別置于500 mL圓底燒瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，讀取揮發(fā)油量，計(jì)算空白回收率。結(jié)果得到揮發(fā)油的量分別為0. 89，0. 90，0. 91 mL，揮發(fā)油空白回收率為90. 0%，RSD為1.11%。

2.1.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化包合工藝 根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究采用較為常用、成本低廉的飽和水溶液法制備包合物，選擇對(duì)揮發(fā)油包合影響較大的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精(β-CD)的配比、包合時(shí)間、包合溫度為主要因素，各因素分設(shè)3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以包合物收得率和揮發(fā)油包合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)包合工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素水平見表1，正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表 3 姜黃揮發(fā)油β-CD包合物制備工藝正交試驗(yàn)方差分析

由表2極差R的大小可知：RA>RB>RC，各因素對(duì)姜黃揮發(fā)油β-CD包合工藝的影響程度依次為A>B>C，即揮發(fā)油：β-環(huán)糊精>包合溫度>包合時(shí)間。其中表3方差分析結(jié)果表明揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的比例對(duì)包合效果有顯著影響，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），包合溫度、包合時(shí)間對(duì)包合效果影響不大。綜合考慮，確定姜黃揮發(fā)油的最佳包合工藝為：A3B3C2，即1 mL 姜黃揮發(fā)油與8 g β-環(huán)糊精進(jìn)行包合，包合物溫度50℃，包合時(shí)間90 min。

2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密量取姜黃揮發(fā)油3份，平行操作，按篩選出的最佳包合工藝A3B3C2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果，得到的揮發(fā)油包合率分別為48.22%，47.76%，49. 54%，平均包合率48.51%，RSD1.91%。包合物收得率分別為67.43%，68.76%，69. 28%，平均收得率68.49%，RSD1.39%。結(jié)果表明，優(yōu)選包合工藝穩(wěn)定可行，具有良好的重現(xiàn)性。

2.2 姜黃揮發(fā)油 β-CD包合物的驗(yàn)證

2.2.1 薄層色譜法[11]取姜黃揮發(fā)油1 mL，作為樣品1； 取適量包合物提取的揮發(fā)油，作為樣品2; 取包合物、姜黃揮發(fā)油與 β-CD的物理混合物、β-CD各1 g，用無(wú)水乙醇10 mL溶解，作為樣品3、4、5; 吸取上述樣品，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9:1）為展開劑，飽和15 min后展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。通過(guò)觀察色譜展開后斑點(diǎn)的有無(wú)、斑點(diǎn)的位置，即可對(duì)包合結(jié)果即包合物是否已經(jīng)形成進(jìn)行直觀鑒別，見圖1。

圖1 姜黃揮發(fā)油包合物薄層層析結(jié)果

由圖1可見，樣品1、3、4在相同位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，樣品2、5無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)出現(xiàn)。樣品1、3的薄層鑒別結(jié)果表明姜黃揮發(fā)油在用 β-CD包合前后化學(xué)成分無(wú)變化，樣品1、2、5的薄層鑒別結(jié)果表明姜黃揮發(fā)油 β-CD包合物已經(jīng)形成且 β-CD對(duì)包合物中揮發(fā)油的測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.2 紫外分光光度法 精密量取姜黃揮發(fā)油、包合物中提取的揮發(fā)油、姜黃揮發(fā)油β-CD包合物、姜黃揮發(fā)油與 β-CD的物理混合物及 β-CD適量，分別加無(wú)水乙醇稀釋溶解，稀釋液濾過(guò)，取續(xù)濾液，以無(wú)水乙醇作空白，在200～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，觀察各自的紫外吸收變化。紫外掃描結(jié)果顯示，姜黃揮發(fā)油、包合物中提取的揮發(fā)油均有吸收，所形成的紫外圖譜基本一致，說(shuō)明姜黃揮發(fā)油與 β-CD形成的包合物并未改變姜黃揮發(fā)油的理化性質(zhì)。同時(shí)，姜黃揮發(fā)油與 β-CD的物理混合物也有吸收，但其波長(zhǎng)出現(xiàn)輕微藍(lán)移，可能是受 β-CD的影響，但二者光譜行為基本一致；而 β-CD則無(wú)吸收，說(shuō)明 β-CD對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾； 姜黃揮發(fā)油β-CD包合物無(wú)吸收，證明包合物已經(jīng)形成。

2.3 姜黃揮發(fā)油包合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)[12]

2.3.1 光穩(wěn)定試驗(yàn) 精密稱取姜黃揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物和按照物料比混勻所得的姜黃揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物適量各3份，平鋪于稱量瓶中，置（強(qiáng)度4500 lx）光照下放置6 d，于第 0，3，6 d取樣，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定揮發(fā)油相對(duì)含量，見表4。結(jié)果表明，包合物在第3、6 d的揮發(fā)油相對(duì)含量有所下降，但下降速度相比物理混合物緩慢，較后者具有良好的光穩(wěn)定性，在強(qiáng)光下不易分解。

2.3.2 高溫試驗(yàn) 精密稱取姜黃揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物和按照物料比混勻所得的姜黃揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物適量各3份，平鋪于稱量瓶中，置（60℃）恒溫干燥箱內(nèi)放置6 d，于第 0，3，6 d 取樣，測(cè)定揮發(fā)油相對(duì)含量，見表4。結(jié)果表明，包合物在第3、6 d的揮發(fā)油相對(duì)含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，但較物理混合物，后者的相對(duì)含油量下降更為明顯，可見姜黃揮發(fā)油β-CD包合物的熱穩(wěn)定性優(yōu)于其物理混合物。

2.3.3 高濕試驗(yàn) 精密稱取姜黃揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物和按照物料比混勻所得的姜黃揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物適量各3份，平鋪于稱量瓶中，置（RH 75 %，25 ℃）的密閉容器中放置6 d。于第 0，3，6 d 取樣，測(cè)定揮發(fā)油相對(duì)含量，見表4。結(jié)果表明，包合物在第 3、6 d的揮發(fā)油相對(duì)含量均有所下降，但是降幅相比物理混合物小，在潮濕條件下，包合物的穩(wěn)定性高于其物理混合物。

表4 姜黃揮發(fā)油包合物和物理混合物的影響因素穩(wěn)定性試驗(yàn)(n =3)

3 結(jié)論與討論

對(duì)于有效成分為揮發(fā)油的活性物質(zhì)，由于揮發(fā)油極易氧化、揮發(fā)，直接將其混合于固體物料中容易造成有效成分的散失，影響制劑療效。近年來(lái)，藥物新技術(shù)β-環(huán)糊精（β-CD）包合技術(shù)在中藥揮發(fā)油制劑中的應(yīng)用，增強(qiáng)了藥物的穩(wěn)定性，提高了藥物的生物利用度和療效。本實(shí)驗(yàn)以揮發(fā)油包合率和包合物收得率加權(quán)綜合評(píng)分值為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了姜黃揮發(fā)油包合物的制備工藝處方。包合物的薄層色譜法和紫外分光光度法鑒別結(jié)果表明包合前后姜黃揮發(fā)油的主要成分基本一致，包合物已經(jīng)形成。姜黃揮發(fā)油β-CD包合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)包合物在強(qiáng)光、高溫、高濕環(huán)境下的穩(wěn)定性均得到了一定改善提高，且通過(guò)包合掩蔽了其不良?xì)馕叮黾恿嘶颊叩氖褂庙槕?yīng)性，達(dá)到了制備包合物的目的。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在揮發(fā)油 β-CD包合物的制備過(guò)程中，對(duì)包合物得率影響較大的因素有揮發(fā)油的投料量和包合溫度。揮發(fā)油的投料量在一定范圍內(nèi)的增加有提高包合物得率的作用，但是當(dāng)投料過(guò)多后則有時(shí)反而會(huì)降低包合效果。常溫下(25℃) β-CD的水溶解度為1.88% , 50℃時(shí)其溶解度可增加至5.27%，所以當(dāng)溫度升高時(shí)使得更多的環(huán)糊精溶解，增加了與揮發(fā)油的更多接觸，從而達(dá)到較好的包合效果，同時(shí)也可避免在溫度過(guò)高攪拌時(shí)所造成揮發(fā)油的逸散[13]。由于揮發(fā)油有一定的黏性，不易分散，在包合時(shí)加入一定量的無(wú)水乙醇對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行稀釋，不僅可以降低揮發(fā)油的黏性，還可以增加油在水中的分散性，進(jìn)而增加了β-CD飽和水溶液中主客分子的碰撞機(jī)會(huì)，有利于包合。

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