HPLC法測定肝素鈉原料中EDTA—2Na的殘留

要輝等

【摘要】目的：建立肝素鈉原料中EDTA-2Na的殘留測定方法。方法：色譜柱：WondaSil-C18 （200mm×46mm×5μm）；流動相：pH為30的0025mol/l硫酸銨溶液；檢測波長：254nm；檢測溫度：室溫；流速：10ml/min；進(jìn)樣量：20μl。結(jié)果：EDTA-2Na在01～1.5μg/ml濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為10009%，RSD為10%。結(jié)論：本法測定肝素鈉中EDTA-2Na具有良好的專屬性、線性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，適用于EDTA-2Na的檢測。

【關(guān)鍵詞】肝素鈉；EDTA-2Na；殘留測定

【中圖分類號】R943【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）16-0028-02

肝素鈉是從豬小腸黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道爾頓，臨床常作為注射劑使用。肝素鈉本身帶負(fù)電荷，能干擾血凝過程的許多環(huán)節(jié)，其作用機(jī)制比較復(fù)雜，主要通過與抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）結(jié)合，而增強(qiáng)后者對活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。具體涉及阻止血小板凝集和破壞，妨礙凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原變?yōu)槟?；抑制凝血酶，從而妨礙纖維蛋白原變成纖維蛋白。肝素鈉作為原料藥，中國藥典中明確規(guī)定了其重金屬限度的檢測，但由于其來源于動物組織提取，實(shí)際生產(chǎn)工藝中均要增加去除重金屬的工藝。目前多采用添加EDTA-2Na來螯合重金屬，形成水溶物后，經(jīng)分級沉淀步驟去除螯合物。EDTA-2Na收載于FDA《非活性組分指南》，可用于非注射和注射給藥制劑，會與人體內(nèi)的鈣離子形成螯合物，引起低血鈣等癥狀。由于肝素鈉生產(chǎn)過程中使用EDTA-2Na去除重金屬，所以在終產(chǎn)品中可能殘留EDTA-2Na，對其進(jìn)行檢測有重要的意義。

1儀器與材料

11儀器TG332A型分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津）；LC-20AD型紫外檢測器（日本島津）；

1.2材料硫酸銅（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；EDTA-2Na（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；肝素鈉（注射級，批號：HM120401、HM120402、HM120403，石家莊市協(xié)和藥業(yè)有限公司）。水為自制純化水（二級反滲透法）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠填料WondaSilC18（200mm×46mm×5μm）；流動相：0025mol/l硫酸銅溶液（用稀硫酸調(diào)節(jié)pH至30）；檢測波長：254nm；流速：10ml/min；檢測溫度：室溫；進(jìn)樣量：20μl。

2.2溶液的制備

2.2.1空白溶液的制備精密量取004mol/l硫酸銅溶液10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.22對照品未絡(luò)合溶液的制備精密稱取EDTA-2Na 10mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品未絡(luò)合溶液的制備精密稱取供試品100mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4對照品溶液的制備精密量取10ml對照品未絡(luò)合溶液，置100ml量瓶中，再精密加入004 mol/l硫酸銅溶液10ml，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5供試品溶液的制備精密稱取供試品100mg，置100ml量瓶中，再精密加入004 mol/l硫酸銅溶液10ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按照2010年版《中國藥典》二部附錄VD高效液相色譜法，檢測波長254nm，分別精密量取空白溶液、供試品溶液、對照品溶液、對照品未絡(luò)合液、供試品未絡(luò)合液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在此色譜條件下，EDTA-2Na經(jīng)硫酸銅絡(luò)合后在254nm處有吸收，硫酸銅與EDTA-2Na峰可完全分離，分離度大于1.5，主峰峰形較好，理論塔板數(shù)大于2000，并且單獨(dú)的硫酸銅、EDTA-2Na、肝素鈉均不干擾測定因此，本方法系統(tǒng)適用性、專屬性良好。

2.4流動相溶液 pH值考察采用不同pH進(jìn)行EDTA-2Na檢查，精密量取對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，考察pH值對本品EDTA-2Na的影響。由表1可知，pH值對對照品的峰面積無影響，且不同pH值條件下的理論塔板數(shù)均大于2000，具有良好的系統(tǒng)適用性。

2.5線性考察分別精密量取對照品溶液01、05、10、1.25、1.5 ml置100ml量瓶中，精密加入004 mol/l硫酸銅溶液10ml，加水稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1ml溶液中含01、05、10、1.25、1.5μg的對照品溶液，分別精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。得線性方程為：y=105938043x-3298098，r=09999。結(jié)果表明，EDTA-2Na在01～1.5μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)平行配制對照品溶液6份，按照上述色譜條件進(jìn)針測定樣品中EDTA-2Na的含量，RSD為026%。說明儀器的精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品，平行制備6份，同法測定，結(jié)果RSD為042%，重現(xiàn)性較好，符合驗(yàn)證方案的要求。

28穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對照品溶液和供試品溶液置室溫放置，分別于0、1、2、3、4h測定。結(jié)果表明樣品溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定。

29回收率實(shí)驗(yàn)為確定本測定方法的準(zhǔn)確度，進(jìn)行了加樣回收率試驗(yàn)。EDTA-2Na貯備液的制備：精密稱取10mg EDTA-2Na，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。120%回收率溶液的制備：精密稱取供試品50mg，置50ml量瓶中，精密加入EDTA貯備液1.2ml，精密加入004 mol/l硫酸銅溶液10ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法分別吸取貯備液10ml及08ml配制100%回收率溶液和80%回收率溶液。分別精密量取以上溶液各20μl注入液相色譜儀，計(jì)算回收率。由表2可知，該方法測定回收率其平均回收率為 10009%，RSD為 10%，表明本方法用于EDTA-2Na測定具有較好的準(zhǔn)確度。

2.10檢測限及定量限取對照品溶液，加水不斷稀釋至適宜濃度，以信噪比為3∶[KG-*3/5]1時的濃度確定檢測限，測得為005μg/ml；以信噪比為10∶[KG-*2]1時的濃度確定定量限，測得為01μg/ml。

2.11樣品測定按照上述所確定的色譜方法檢測批號為HM120401、HM120402、HM120403中的EDTA-2Na殘留量，三批樣品分別為001%，001%，000%。

3討論

EDTA-2Na的檢測方法較多，常用的有滴定法和比色法，但這些方法的選擇性不高，專屬性不好。本研究選用專屬性較好的HPLC法來測定，回收率較好，準(zhǔn)確度高，符合驗(yàn)證方法的要求。另外，銅離子可與EDTA-2Na形成較為穩(wěn)定的螯合物，保證了室溫放置4h其性質(zhì)不變。綜上所述，HPLC法檢測EDTA-2Na的殘留具有很好的靈敏度，準(zhǔn)確度，簡單方便。

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（收稿日期：20150515）