不同產(chǎn)地山羊角凝膠電泳指紋圖譜及其混偽品鑒別研究△

康馨元，劉睿，李春楠，孫佳明，張輝*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

不同產(chǎn)地山羊角凝膠電泳指紋圖譜及其混偽品鑒別研究△

康馨元1，劉睿2，李春楠1，孫佳明1，張輝1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

目的：研究建立不同產(chǎn)地山羊角藥材的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的指紋圖譜以及與混偽品的鑒別方法。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)山羊角及其偽品的蛋白成分進(jìn)行分析比較。結(jié)果：不同產(chǎn)地山羊角電泳圖譜相似，有5個(gè)共有帶峰，可作為山羊角的專屬條帶。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單易行、靈敏度高，可為山羊角的產(chǎn)地鑒別及與偽品的鑒別提供參考。

山羊角；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；指紋圖譜

山羊角為?？苿?dòng)物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角。其首載于《本草新編》，曰：“?；钏姥盵1]。山羊角味咸，性寒。無毒。具有清熱、鎮(zhèn)驚、散瘀止痛等功能。其成分主要有甾族、磷脂類、角蛋白、水溶性蛋白、多肽及氨基酸類成分[2-5]?！夺t(yī)林纂要》記載“功用近羚羊角”。山羊角和羚羊角化學(xué)成分及藥理作用基本相同，均有解熱、鎮(zhèn)靜、催眠作用，山羊角的鎮(zhèn)靜作用稍強(qiáng)[6]。由于羚羊角數(shù)量稀少，藥材主要靠進(jìn)口，故山羊角是羚羊角的理想替代品[7]。因此，本試驗(yàn)收集10批不同產(chǎn)地山羊角樣品，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法，通過凝膠電泳圖像分軟件和中藥指紋圖譜相似度軟件，進(jìn)行了山羊角蛋白SDS-PAGE指紋圖譜研究，并與綿羊角、水牛角、牛蹄甲進(jìn)行對(duì)比，旨在建立一種快速、簡(jiǎn)便的山羊角專屬性鑒定方法，為山羊角藥材的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)、與羚羊角蛋白質(zhì)類的成分對(duì)比研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DYY-10C型電泳儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽(北京市六一儀器廠)；TGL-16B型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；BSA124S-CW電子天平、酸度計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；FD-1000真空冷凍干燥裝置(日本)；HS2060型超聲波清洗器(HENGAO T&D)；WP-UP-III-40超純水系統(tǒng)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑

丙烯酰胺(AMRESCO)；N-N甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(北京鼎國(guó)生物公司Genview分裝)；過硫酸銨(北京鼎國(guó)生物公司 Sigma分裝)；考馬斯亮藍(lán)G-250(北京鼎國(guó)生物公司)；Marker(TIANGEN)；β-巰基乙醇(Sigma)；TEMED(AMRESCO)；磷酸氫二鈉、甲醇、乙酸、鹽酸(北京化工廠)；去離子水。

1.3 材料

山羊角藥材來源于浙江、河北、江蘇、廣東、黑龍江、內(nèi)蒙古、安徽7省共10個(gè)地區(qū)，由東豐制藥有限公司提供，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心張輝教授鑒定為?？苿?dòng)物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角，見表1。偽品包括水牛角(吉林大藥房)、牛蹄甲(吉林省敦化市)以及綿羊角(吉林省大安市)。

表1 山羊角藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取10批山羊角以及偽品粉末各0.5 g，放入乳缽，分別加裂解液(含8 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲)5 mL，研磨20 min，成勻漿，置離心管中(3000 r·min-1)離心20 min，取上清液，凍干，備用[4]。

2.2 SDS-PAGE法測(cè)定

2.2.1 電泳 將配制好的試劑按所需丙烯酰胺比例，配制12%分離膠溶液，待分離膠聚合后，在其上方灌注5%濃縮膠溶液，并立即插入干凈的樣品梳，注意避免氣泡產(chǎn)生。濃縮膠聚合完全后，小心移出樣品梳，把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。取樣品凍干粉各約0.5 g，分別加入150 μL十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(未加二硫蘇糖醇)、20 μL巰基乙醇，加熱煮5 min以使蛋白變性。按預(yù)定順序加樣，每份樣品10 μL，由于供試品由尿素裂解液提取，變性后的樣品在室溫下極易凝固，故加樣過程需快速完成。接上電源，調(diào)節(jié)電壓(濃縮膠恒定電壓為70 V，分離膠恒定電壓為140 V)。樣品在電流的驅(qū)動(dòng)下向前移動(dòng)，待移動(dòng)到前沿處即可停止。

2.2.2 染色、脫色及凝膠保存 預(yù)先配制考馬斯亮藍(lán)染液，即在1 g考馬斯亮藍(lán)中分別加入200 mL甲醇、50 mL冰醋酸和250 mL水，混勻。用至少5倍體積的染色液浸泡凝膠，放在數(shù)顯水浴恒溫振蕩器上，37 ℃平緩搖動(dòng)，染色約4 h。將染色液替換成由甲醇-水-冰醋酸(9∶9∶2)配制成的脫色液，于數(shù)顯水浴恒溫振蕩器上37 ℃平緩搖動(dòng)，直至條帶顯現(xiàn)但凝膠底色還稍顯藍(lán)色時(shí)取出凝膠，保存于水中，浸泡2 d后置于凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行分析。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取產(chǎn)于河北安國(guó)的山羊角藥材按2.1方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、1、2、4、6、12、24 h觀察供試品溶液有無變化，并取樣進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，考察主要共有蛋白帶的一致性。結(jié)果表明，供試品中各主要共有蛋白帶無缺失，在測(cè)定的24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批山羊角藥材(河北安國(guó))，按2.1方法分別制得5份供試品溶液，進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，考察主要共有蛋白帶的一致性。通過LabWorks 4.6圖像捕獲/分析軟件進(jìn)行分析，再經(jīng)origin軟件積分峰面積，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”中進(jìn)行相似度分析。結(jié)果表明，相似度為0.993～0.997，說明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一批山羊角藥材(河北安國(guó))，按2.1方法制備供試品溶液，在同一塊SDS-PAGE膠片上，取6次樣品間隔上樣，考察各共有蛋白帶的相對(duì)距離漂移情況。通過LabWorks 4.6圖像捕獲/分析軟件進(jìn)行分析，再經(jīng)origin軟件積分峰面積，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”中進(jìn)行相似度分析。結(jié)果表明，相似度為0.991～0.999，供試品進(jìn)樣精密度良好。

2.4 SDS-PAGE指紋圖譜建立

2.4.1 對(duì)照指紋圖譜及相似度分析 將10批樣品及3批偽品的供試品溶液分別上樣，得到不同樣品蛋白的SDS-PAGE電泳膠片，見圖1。大部分山羊角樣品均明顯出現(xiàn)5條蛋白帶，相對(duì)分子質(zhì)量分別約為63 KDa、60 KDa、55 KDa、51 KDa、46 KDa，其中60 KDa、46 KDa蛋白帶濃度相對(duì)較高。膠片經(jīng)凝膠分析軟件生成圖譜后，采用Origin7.5軟件生成疊加圖，見圖2。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”得到樣品的對(duì)照指紋圖譜及偽品指紋圖譜，見圖3～6。國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”軟件將10批樣品分別與對(duì)照?qǐng)D譜比較，相似度除河北保定、廣東電白以及浙江紹興外均在0.800～1.000之間。以生成的對(duì)照?qǐng)D譜為參照，計(jì)算得到偽品藥材綿羊角、牛蹄甲以及水牛角指紋圖譜，相對(duì)于對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均低于0.600，見表2。

a.浙江金華；b.江蘇盱眙；c.黑龍江雞西；d.內(nèi)蒙古阿拉善；e.河北安國(guó)；f.浙江縉云；g.安徽合肥；h.Marker；i.浙江紹興；j.河北保定；k.廣東電白；l.牛蹄甲；m.水牛角；n.綿羊角。圖1 山羊角蛋白SDS-PAGE電泳膠片

注：1～10為不同產(chǎn)地山羊角樣品。圖2 10批山羊角樣品SDS-PAGE指紋圖譜疊加圖

注：1.分子質(zhì)量為63 KDa；2.分子質(zhì)量為60 KDa；3.分子質(zhì)量為55 KDa；4.分子質(zhì)量為51 KDa；5.分子質(zhì)量為46 KDa。圖3 山羊角蛋白SDS-PAGE對(duì)照指紋圖譜

圖4 偽品綿羊角SDS-PAGE指紋圖譜

圖5 偽品牛蹄甲SDS-PAGE指紋圖譜

圖6 偽品水牛角SDS-PAGE指紋圖譜

表2 10批樣品及偽品相似度

2.4.2 特征指紋峰標(biāo)定 在圖和表中可看出5個(gè)特征峰的相對(duì)遷移率Rf值分別為0.443 5、0.465 6、0.520 4、0.563 7、0.612 3。通過分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白得到相對(duì)遷移率(Y)與相對(duì)分子質(zhì)量(X)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-0.009 4X+1.038(r=0.878 2)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到5個(gè)共有帶峰的相對(duì)分子質(zhì)量，見表3。將圖3按照相對(duì)遷移率可分為兩個(gè)區(qū)段：Rf值在0～0.540之間為第一區(qū)段，有1(63 KDa)、2(60 KDa)、3(55 KDa)三個(gè)蛋白帶峰，峰1和峰2為相對(duì)強(qiáng)峰，峰3在不同產(chǎn)地樣品圖譜中略有不同；Rf值在0.540～1.000之間為第二區(qū)段，有三個(gè)蛋白帶峰，但由于Rf值為0.800的蛋白帶峰較為彌散，不能作為獨(dú)立條帶，考慮為相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白，有待將山羊角蛋白進(jìn)行砍段處理后進(jìn)一步研究，故本實(shí)驗(yàn)選擇該區(qū)段內(nèi)4(51 KDa)、5(46 KDa)兩個(gè)蛋白帶峰作為特征帶峰，其中峰5為最強(qiáng)峰。

表3 SDS-PAGE凝膠電泳圖像的5個(gè)特征帶峰分析參數(shù)

3 討論

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在分離蛋白質(zhì)、多肽等大分子方面具有高分辨率、高靈敏度、分析時(shí)間短、用量少等特點(diǎn)[8]，又因其穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性較好而被廣泛應(yīng)用[9]。本試驗(yàn)借助聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地山羊角樣品進(jìn)行了分離，并采用凝膠分析軟件與Origin軟件相結(jié)合的方法，將樣品電泳譜帶生成更加直觀的疊加圖，以專屬條帶數(shù)目、蛋白質(zhì)電泳Rf值、蛋白質(zhì)豐度等作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，并通過相似度軟件進(jìn)行相似度分析，通過技術(shù)參數(shù)提供更可靠的鑒別依據(jù)。為保證該方法的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明SDS-PAGE電泳方法呈現(xiàn)良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性以及精密度。

從上述山羊角樣品指紋圖譜疊加圖可見，10批不同產(chǎn)地山羊角的SDS-PAGE指紋圖譜在譜帶位置、條數(shù)、帶型上無顯著性差異；產(chǎn)自河北安國(guó)的樣品有一特征譜帶，說明河北安國(guó)山羊角的蛋白組成具有一定的產(chǎn)地差異；河北保定、廣東電白以及浙江紹興樣品譜帶清晰度低于其他產(chǎn)地樣品，可能與樣品有效成分含量不同有關(guān)。將樣品圖譜導(dǎo)入到相似度軟件生成對(duì)照?qǐng)D譜，從中清晰可見5條共有條帶，混偽品電泳圖譜與之相比差異較為顯著，因此可以將對(duì)照?qǐng)D譜所顯示的5條特征條帶作為山羊角專屬條帶，相對(duì)分子質(zhì)量分別約為63 KDa、60 KDa、55 KDa、51 KDa、46 KDa。

本研究方法建立的指紋圖譜可快速地對(duì)山羊角偽品與正品進(jìn)行鑒別和區(qū)分，為山羊角藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制，進(jìn)一步完善和深入研究山羊角藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，與羚羊角蛋白質(zhì)類的成分對(duì)比研究提供了參考依據(jù)。

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StudiesonSDS-PAGEFingerprintsChromatogramofCaprahireusfromDifferentAreasandItsAdulterants

KANG Xinyuan1，LIURui2，LIChunnan1，SUNJiaming1，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China；2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

Objective：To establish the SDS-PAGE fingerprints and an identification method forCaprahireusL.collected from different areas and its adulterant.Methods：The SDS-PAGE method was adopted to compare the difference ofC.hireusand its adulterants.Results：It showed a similar electrophoretic patterns forC.Hireusof different origins.Five common peaks were determined as characteristic bands.Conclusion：The established method is simple and sensitive.It can provide the basis for identification of habitats and adulterants.

CaprahireusL.；SDS-PAGE；fingerprints

2014-08-15)

角類動(dòng)物藥的標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目——國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高暨2015版藥典科研任務(wù)(2012)

*

張輝，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：天然藥物化學(xué)；Tel：(0431)86172080，E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.005