基于組分結(jié)構(gòu)理論探討亳菊花硫磺熏蒸前后化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異

陳建衡

(山東省泰山療養(yǎng)院 藥劑科，山東 泰安 271000)

·基礎(chǔ)研究·

基于組分結(jié)構(gòu)理論探討亳菊花硫磺熏蒸前后化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異

陳建衡*

(山東省泰山療養(yǎng)院 藥劑科，山東 泰安 271000)

目的：研究亳菊花硫磺熏蒸前后化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異，并討論硫磺熏蒸對亳菊花質(zhì)量的影響。方法：建立硫磺熏蒸前后亳菊花的化學(xué)成分指紋圖譜，采用HPLC-DAD色譜法測定亳菊花中主要活性成分綠原酸和木犀草素在硫磺熏蒸前后的含量變化。ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：324 nm(綠原酸)和348 nm(木犀草素)，柱溫25 ℃。結(jié)果：經(jīng)硫磺熏蒸過后的亳菊花中2、4、7、8、9、10號指紋峰所代表的成分含量均有不同程度的下降；亳菊花經(jīng)硫磺熏蒸過后，綠原酸含量平均值由(3.68 ± 0.06)g·kg-1增加為(4.91 ± 0.01)g·kg-1(P<0.01)，木犀草素含量平均值無顯著變化。結(jié)論：亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸后，亳菊花原有的化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這一變化將影響到硫熏亳菊花的安全性和有效性，因此對其臨床使用有待進(jìn)一步研究。

亳菊花；硫磺熏蒸；綠原酸；木犀草素；化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異

硫磺熏蒸法雖然能實(shí)現(xiàn)防腐、防霉、防蟲蛀、有利于干燥和增色[1]，但是硫磺熏蒸存在的問題日益受到關(guān)注，并存在對硫磺熏蒸法是摒棄還是傳承的質(zhì)疑[2]，硫磺熏蒸對中藥材品質(zhì)具有一定程度的負(fù)面影響[3]。2013年，國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)“中藥材硫磺熏蒸替代技術(shù)及規(guī)范化研究”項(xiàng)目也已經(jīng)順利啟動[4]。亳菊花ChrysanthemummorifoliumRamat.為菊科菊屬植物，味甘、苦，微寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，平肝明目，清熱解毒之功效。用于治療風(fēng)熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛等癥[5]。研究表明，亳菊花具有抗菌、抗病毒、抗炎、擴(kuò)張冠狀動脈、降低血壓、預(yù)防高血脂、抗衰老等活性[6-9]。已有研究表明，硫熏過程多采用工業(yè)硫磺，會殘留大量的二氧化硫并影響到亳菊花中主要成分的變化，人體食用硫磺熏蒸過的中藥材會刺激呼吸道黏膜，引起氣管炎、支氣管炎等呼吸道疾病和肝臟損傷，實(shí)驗(yàn)小鼠吸入二氧化硫或食用二氧化硫衍生物可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)DNA損傷[10]。但是，硫熏亳菊花(毒亳菊花)的報道屢見不鮮，影響到亳菊花的用藥安全性和有效性[4]。我們前期研究表明，經(jīng)過硫磺熏蒸后，亳菊花中的銅、鉛、砷等有害元素的含量會呈現(xiàn)不同程度的升高[11]。此外，硫磺熏蒸也會使得亳菊花中部分活性成分發(fā)生變化[12]。本研究系統(tǒng)闡述了亳菊花硫磺熏蒸前后其化學(xué)成分的含量變化和化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，配備Agilent1200色譜工作站和DAD二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；METTLERAL204十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2試藥

升華硫(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20121211)，綠原酸對照品(批號：110753-200413)和木犀草素對照品(批號：111520-200504)購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

陰性亳菊花由亳州市輝睿中藥科技有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定為菊科菊屬植物菊，陽性亳菊花由實(shí)驗(yàn)室用陰性亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸自制。

2 方法與結(jié)果

2.1硫熏亳菊花的制備

稱取陰性亳菊花適量于干燥器中，以適量水潤濕30min，取10%藥量的升華硫，點(diǎn)燃，置于同一干燥器中，以凡士林涂抹蓋口密閉容器，持續(xù)熏蒸24h。取出，置45℃烘箱內(nèi)12h，待烘干后粉碎，待用。

2.2色譜條件

ZORBAXSB-C18反相色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～8min，2%A；8～10min，2%～7%A；10～20min，7%～47%A；20～30min，47%～60%A；30～40min，60%～70%A)；體積流量：1.0mL·min-1；檢測波長：324nm(綠原酸)和348nm(木犀草素)；柱溫：25℃。

2.3供試品溶液的制備

取陰性、陽性亳菊花，打粉處理(60目篩)，各取約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率250W，頻率25kHz)30min，放冷，稱定質(zhì)量，以50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，離心，作為供試品溶液。

2.4指紋圖譜的建立

2.4.1指紋圖譜的構(gòu)建 取5份陰性供試品溶液與3份陽性供試品溶液，分別進(jìn)樣40μL，按上述色譜條件進(jìn)行分析，選取324nm檢測波長下的8份樣品的高效液相色譜圖進(jìn)行疊加，作為定性鑒別的參考譜圖[13-14]，見圖1。

2.4.2共有指紋峰的標(biāo)定 采用相對保留時間標(biāo)定共有指紋峰，以圖譜中綠原酸(3號指紋峰)色譜峰為參照峰，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照峰的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，計(jì)算8批樣品指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間，分別為0.873(1號指紋峰)、0.966(2號指紋峰)、1.000(3號指紋峰)、1.043(4號指紋峰)、1.195(5號指紋峰)、1.208(6號指紋峰)、1.265(7號指紋峰)、1.304(8號指紋峰)、1.561(9號指紋峰)、1.711(10號指紋峰)。選取其中各樣品所共有的10個峰面積較大且分離度較好的色譜峰，標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰。

2.4.3共有峰的相對峰面積 以圖譜中綠原酸(3號指紋峰)色譜峰為參照峰，將各色譜峰峰面積與同一圖譜參照峰的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對峰面積。見表1。

2.4.4非共有峰峰面積 計(jì)算非共有峰占總峰面積的比值。結(jié)果表明，其比值小于5%，符合指紋圖譜的要求。

2.5線性關(guān)系考察

精密吸取綠原酸、木犀草素對照品母液，分別加甲醇制成2、4、6、8、10、50μg·mL-1質(zhì)量濃度的對照品溶液，搖勻，作為對照品溶液，分別精密進(jìn)樣40μL，按2.2中色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，綠原酸回歸方程為Y=56.56X-9.90，r=0.999 8，木犀草素回歸方程為Y=61.71X-10.55，r=0.999 9，表明綠原酸和木犀草素在2.0～50.0 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。

注：S1～S3.硫磺熏蒸后的亳菊花HPLC圖譜；S4～S6.硫磺熏蒸前的亳菊花HPLC圖譜；S7～S8.硫磺熏蒸前的亳菊花加標(biāo)HPLC圖譜；3號峰為綠原酸；9號峰為木犀草素。圖1 亳菊花樣品HPLC指紋圖譜

編號相對峰面積12345678910S10.0400.1011.0000.1622.9982.0330.6180.4930.5341.137S20.0430.0981.0000.1673.0272.0760.6180.4940.5220.942S30.0400.0951.0000.1673.0072.0820.6210.4900.5230.929S40.3280.2081.0000.1993.1052.0880.8850.8230.6151.408S50.3230.2291.0000.1893.1272.2090.9740.8700.5901.368S60.3270.2271.0000.1933.1172.2190.9790.8720.6141.327S70.2630.1771.0000.1522.5121.7310.7390.6970.5201.148S80.2590.2041.0000.2362.3511.6850.7450.6860.4871.081

2.6方法學(xué)考察

2.6.1精密度試驗(yàn) 取綠原酸和木犀草素對照品溶液各200μL加入600μL甲醇制成混合對照品溶液，按上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果綠原酸和木犀草素峰面積的RSD分別為1.17%和1.86%。

2.6.2重現(xiàn)性試驗(yàn) 取供試樣品6份，制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，計(jì)算綠原酸、木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，樣品中綠原酸、木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.16%和2.07%。

2.6.3回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品粉末0.1g，并分別按0.5倍、1.0倍和1.5倍加對照品，用50%甲醇分別定容至50mL，超聲提取30min，放冷，補(bǔ)足失量，離心，分別進(jìn)樣40μL，按上述色譜條件測定綠原酸和木犀草素的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，木犀草素的回收率在81.05%～92.64%，綠原酸的回收率在100.52%～111.87%，見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)(n =3)

2.7樣品測定

取陰性和陽性樣品各3份，制備供試品溶液，進(jìn)樣40μL，按上述色譜條件測定，計(jì)算樣品中的綠原酸和木犀草素含量，結(jié)果見表3。

表3 亳菊花經(jīng)硫磺熏蒸前后綠原酸和木犀草素含量變化 /g·kg-1

注：與亳菊花(非硫熏)組相比，*P<0.01。

3 討論

3.1亳菊花樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)對3份陰性亳菊花樣品、3份陽性亳菊花樣品以及2份陰性加標(biāo)亳菊花樣品進(jìn)行HPLC圖譜分析，進(jìn)而初步建立了亳菊花樣品的指紋圖譜，目的是為了定性地檢測亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸過后成分的種類和數(shù)量的變化情況。S1～S3譜圖為陽性亳菊花樣品，S4～S6為陰性亳菊花樣品，S7～S8為陰性加標(biāo)亳菊花樣品。從指紋圖譜上可以較為直觀地觀察到，陽性亳菊花樣品HPLC譜圖中的1號指紋峰相比于陰性亳菊花樣品幾乎消失，從數(shù)據(jù)上看，其相對峰面積也大幅度下降，這說明此成分的含量在亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸過后會大幅下降；同樣，綜合指紋圖譜和相對峰面積數(shù)據(jù)可以知道，經(jīng)硫磺熏蒸過后的亳菊花中2、4、7、8、9、10號指紋峰所代表的成分含量均有不同程度的下降，這也表明了硫磺熏蒸會引起亳菊花中的部分成分含量下降，進(jìn)而可能影響藥效。這一現(xiàn)象可能是硫磺熏蒸中藥存在的共性問題[12]。

3.2綠原酸、木犀草素含量分析

SPSS16.0軟件被用于亳菊花硫磺熏蒸前后綠原酸和木犀草素的含量差異性分析，結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)顯示，亳菊花經(jīng)硫磺熏蒸過后，綠原酸含量平均值由3.68g·kg-1增加為4.91g·kg-1，含量上升較為明顯(P<0.01)；木犀草素含量平均值由3.75g·kg-1增加為3.81g·kg-1，含量上升不明顯。我們推測，硫熏亳菊花中綠原酸含量的增加，可能是某些未知有機(jī)酸類成分在硫熏過程中轉(zhuǎn)化成了綠原酸。

綠原酸是亳菊花中的主要成分，硫磺熏蒸后其含量顯著增加，并不能說明硫熏過程能夠增強(qiáng)亳菊花藥效。因?yàn)?，中藥發(fā)揮最佳藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所具有的獨(dú)特的化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)，某一種成分的含量高低并不是主要原因[15]。亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸，雖然綠原酸的含量有所升高，但其中2、4、7、8、9、10號指紋峰所代表的成分含量均有不同程度的下降。因此，硫磺熏蒸改變了亳菊花的化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)，很有可能極大地降低了亳菊花的藥效。

3.3化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)差異性

亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸后，亳菊花中的化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，不僅伴隨著某些成分的含量降低(如2、4、7、8、9、10號指紋峰)，也有某些成分的含量增加(如綠原酸)，還有某些成分的含量無顯著變化(如木犀草素)。因此，亳菊花經(jīng)過硫磺熏蒸后，雖然沒有產(chǎn)生新的化合物，但是亳菊花原有的化學(xué)成分組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。綜上所述，我們認(rèn)為亳菊花經(jīng)硫磺熏蒸后，其原有的藥理作用也隨之變化，甚至可能產(chǎn)生一定的毒副作用。我們也將進(jìn)一步研究亳菊花硫磺熏蒸前后的藥理活性的差異。

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StudiesonDifferenceofChemicalCompositionandStructureofChrysanthemumpreandpostSulfurFumigation

CHENJianheng*

(ShandongProvinceTaishanSanatoriumPharmacy，Taian271000，China)

Objective：To describe the difference of chemical composition and structure of Chrysanthemum pre and post sulfur fumigation，and discuss the influence of sulfur fumigation on the quality of Chrysanthemum.Methods： The determination was carried out by HPLC-DAD method with a ZORBAX SB-C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)，eluted with the mobile phase of methanol(solvent A)-0.3% phosphoric acid(solvent B)(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The temperature of column was 25 ℃. The detection wavelength for chlorogenic acid and luteolin were 324 nm and 348 nm，respectively. Fingerprint of chemical composition of Chrysanthemum pre and post sulfur fumigation was established and the content changes of main active component were determined.Results： After sulfur fumigation，component content represented by fingerprint peaks of 2，4，7，8，9，10 all decreased to some extent，the average content of chlorogenic acid increased from (3.68± 0.06) g·kg-1to(4.91±0.01) g·kg-1，while there was no significant change in luteolin.Conclusion：The original chemical composition and structure of Chrysanthemum changed. This change will affect its safety and effectiveness. Therefore，the further study of its clinical use should be continued.

Chrysanthemum；sulfur fumigation；chlorogenic acid；luteolin；difference of chemical composition and structure.

*

陳建衡，主管中藥師，E-mail：jiangjuntcm2007@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.011

2015-04-08)