血竭素高氯酸鹽通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡

王瑩，劉樂(lè)天，楊柳，王海燕

(1.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 護(hù)理部，吉林 長(zhǎng)春 130000)

·基礎(chǔ)研究·

血竭素高氯酸鹽通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡

王瑩1，劉樂(lè)天1，楊柳1，王海燕2*

(1.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130000；2.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 護(hù)理部，吉林 長(zhǎng)春130000)

目的：研究血竭素高氯酸鹽(Dracorhodin Perchlorate，DP)抗乳腺癌作用及作用機(jī)制。方法：四甲基噻唑藍(lán)法分析60μmol·L-1DP作用不同時(shí)間后，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率；細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析、細(xì)胞核形態(tài)學(xué)分析和DNA片段化分析確定細(xì)胞凋亡的發(fā)生；Rhodamine123染色分析細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位；Western檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)特別是線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：60μmol·L-1DP時(shí)間依賴(lài)性地抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)；DP抑制細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)；DP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，其活化了線(xiàn)粒體通路蛋白caspase-9，剪切了DNA損傷修復(fù)蛋白PARP；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因是其降低了細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位(正常膜電位細(xì)胞百分比93.11%；DP處理后正常膜電位細(xì)胞百分比37.45%)；而線(xiàn)粒體上Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)減少，Bax、Bak增多是DP改變線(xiàn)粒體膜電位的主要原因。結(jié)論：DP通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

血竭素高氯酸鹽；凋亡；線(xiàn)粒體蛋白

血竭為棕櫚科植物麒麟竭DaemonoropsdracoB1.果實(shí)滲出的樹(shù)脂經(jīng)加工制成。此外，龍舌蘭科植物龍血樹(shù)的樹(shù)脂也作為血竭用。血竭主要成分為血竭素和血竭紅素[1]。血竭素高氯酸鹽(Dracorhodin perchlorate，DP)為人工合成品[2]，其具有抗宮頸癌作用[3]。人乳腺癌和宮頸癌為婦科主要癌癥，本研究探討血竭素高氯酸鹽抗人乳腺腫瘤作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)血竭素高氯酸鹽為抗婦科腫瘤藥物提供參考。

1 材料

1.1主要試藥

血竭素高氯酸鹽(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；應(yīng)用時(shí)用二甲基亞砜(DMSO)溶解，并使DMSO的終濃度低于0.1%。DMSO、細(xì)胞核染料Hoechst3258、線(xiàn)粒體染料Rhodamine123(Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)，胎牛血清(北京元亨圣馬生物試劑公司)。PARP、Caspase-9、Histone、Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak抗體及二抗(SantaCruz公司，CA，USA)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)(美國(guó)AmericanTypeCultureCollection，ATCC)。細(xì)胞單層接種在含10%胎牛血清、20g·L-1谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1MTT分析抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(細(xì)胞數(shù)為每孔1×104個(gè))，每孔100μL培養(yǎng)12h后再加入60μmol·L-1DP，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)平行孔3個(gè)，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48h，每孔加入5g·L-1MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，加入150μL DMSO溶解，于酶標(biāo)儀492nm處檢測(cè)，計(jì)算藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞的離體生長(zhǎng)抑制率。

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，加入60μmol·L-1DP于24h用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

2.3細(xì)胞核形態(tài)學(xué)分析

全區(qū)設(shè)立有自治區(qū)級(jí)、市級(jí)、縣級(jí)、鄉(xiāng)鎮(zhèn)四級(jí)社會(huì)保險(xiǎn)征收服務(wù)機(jī)構(gòu)，而稅務(wù)部門(mén)根據(jù)稅源變化的特點(diǎn)，已收縮鄉(xiāng)鎮(zhèn)征收機(jī)構(gòu)，大多集中到縣級(jí)，對(duì)城鄉(xiāng)居民養(yǎng)老保險(xiǎn)和醫(yī)療保險(xiǎn)，尤其鄉(xiāng)鎮(zhèn)居民保險(xiǎn)的征收管理帶來(lái)一定程度的不便。

細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，加入60μmol·L-1DP于培養(yǎng)的24h加入4%多聚甲醛固定15min，棄固定液，用PBS洗1次，加入終濃度200μmol·L-1Hoechst33258染色30min，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.4DNA片段化分析

收集細(xì)胞，提取DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色后紫外燈下觀察[3]。

2.5Rhodamine染色分析線(xiàn)粒體膜電位

按每孔5×105個(gè)細(xì)胞將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，24h后加入60μmol·L-1DP作用24h，然后加入5mg·L-1Rhodamine123在37℃孵育30min。孵育過(guò)后，細(xì)胞用PBS洗兩次。熒光顯微鏡下觀察Rhodamine123染色的強(qiáng)度。

2.6Western blot 分析蛋白表達(dá)

收集5×106個(gè)以上細(xì)胞，1000×g 離心10min，PBS洗兩次，加入80μL 細(xì)胞裂解液(50mmol·L-1HEPES，1% Triton-100，100mmol·L-1NaF，1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1EGTA，2mmol·L-1正釩酸鈉，1mmol·L-1PMSF，10g·L-1Pepstatin A)于冰上裂解1h，25000×g離心5min，收集上清液。加入20μL5×上樣緩沖液[250mmol·L-1Tris-HCl(pH6.8)，100g·L-1SDS，50%甘油，5g·L-1溴酚蘭，5%二巰基乙醇]，沸水中煮3min，使蛋白變性。每個(gè)點(diǎn)樣孔加樣15μL樣品液，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)。凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉液封閉膜上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)2h。加入一抗及堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，顯色。

細(xì)胞線(xiàn)粒體的裂解：收集的細(xì)胞餅加入100μL 裂解液，裂解液包括sucrose250mmol·L-1，Hepes20mmol·L-1，KCl10mmol·L-1，MgCl21.5mmol·L-1，EDTA1mmol·L-1，EGTA1mmol·L-1，dithiothreitol(DTT)1mmol·L-1，PMSF1mmol·L-1(pH7.5)，aprotinin1mg·L-1，leupeptin1mg·L-1。然后在4℃冰上裂解1h。12000×g離心30min，離心的沉淀加入30μL 裂解液[Hepes50mmol·L-1(pH7.4)，1% Triton-X100，NaF100mmol·L-1，EDTA1mmol·L-1，EGTA1mmol·L-1Sodium orthovanadate PMSF1mmol·L-1，leupeptin10mg·L-1，aprotinin10mg·L-1，pepstatin A10mg·L-1]。在冰上裂解1h。12000×g離心30min，裂解液中包含線(xiàn)粒體蛋白。

3 結(jié)果

3.1DP的抗腫瘤作用

DP作用12、24、36、48h后，其抑制率為(25.4±1.67)%、(38.58±1.71)%、(47.12±1.10)%、(59.89±1.47)%(見(jiàn)圖1)。我們采用60μmol·L-1作為實(shí)驗(yàn)濃度。

3.2DP對(duì)凋亡的影響

細(xì)胞凋亡時(shí)，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化，例如細(xì)胞浮起變圓，凋亡小體出現(xiàn)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞浮起變圓，出現(xiàn)凋亡小體，而對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，沒(méi)有細(xì)胞死亡(見(jiàn)圖2A)。同樣，細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞核皺縮，熒光染料Hoechst33258染色增強(qiáng)。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞核大小均勻，顏色一致，而60μmol·L-1DP處理24h后，細(xì)胞核皺縮變亮(見(jiàn)圖2A)。DNA 片段化(DNA ladder)是凋亡的標(biāo)志，我們發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，出現(xiàn)DNA片段化(見(jiàn)圖2B)。PARP蛋白[5]是DNA損傷修復(fù)蛋白，我們發(fā)現(xiàn)DP處理后，PARP表達(dá)降低，說(shuō)明DP降低DNA修復(fù)能力(見(jiàn)圖2C)。以上結(jié)果說(shuō)明DP誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

注：A.DP化學(xué)結(jié)構(gòu)；B.MTT分析DP處理不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤抑制率。圖1 血竭素高氯酸鹽(DP)對(duì)乳腺癌MCF-7的抑制作用

注：A.A1、A2圖片分析DP處理24 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，箭頭指示細(xì)胞的凋亡小體。A3、A4圖片分析DP處理24 h后細(xì)胞核形態(tài)變化，箭頭指示皺縮的細(xì)胞核。B.DP處理24 h后，DNA片段化情況，箭頭指示片段化的DNA。C.Western分析PARP蛋白表達(dá)，Histone為細(xì)胞內(nèi)參。圖2 DP對(duì)乳腺癌MCF-7凋亡的影響

3.3DP與線(xiàn)粒體途徑的相關(guān)性

60μmol·L-1DP處理24h后，具有正常膜電位的細(xì)胞百分比為37.45%，而對(duì)照組具有正常線(xiàn)粒體膜電位的細(xì)胞百分比為93.11%，也就是說(shuō)55.66%的細(xì)胞在DP處理后線(xiàn)粒體膜電位降低(見(jiàn)圖3A)。Caspase-9是線(xiàn)粒體通路蛋白，線(xiàn)粒體途徑被激活后，其由Pro-caspase-9轉(zhuǎn)化為caspase-9后被活化，進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，活化的caspase-9表達(dá)增加(見(jiàn)圖3B)，說(shuō)明DP降低線(xiàn)粒體膜電位后，激活caspase-9來(lái)介導(dǎo)凋亡。

注：A：DP處理24 h線(xiàn)粒體膜電位情況，***P<0.001。B：DP處理24 h后，Western分析caspase-9蛋白表達(dá)，Histone為細(xì)胞內(nèi)參。圖3 DP對(duì)線(xiàn)粒體途徑的影響

3.4線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白的分布

線(xiàn)粒體膜電位降低的主要原因是線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白表達(dá)和分布改變。我們提取總的線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，具有降低膜電位功能的Bax蛋白表達(dá)增加，而具有穩(wěn)定膜電位功能的Bcl-2蛋白表達(dá)降低，但DP對(duì)Bak、Bcl-XL蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯的影響(見(jiàn)圖4A)。繼而我們分離了細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體，觀察蛋白在線(xiàn)粒體的分布。研究發(fā)現(xiàn)具有降低膜電位功能的Bax、Bak表達(dá)增加，而具有穩(wěn)定膜電位功能的Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)降低。所以DP有改變線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白表達(dá)和定位的能力。

注：A.DP處理24 h后細(xì)胞線(xiàn)粒體蛋白的表達(dá)情況，Histone為細(xì)胞內(nèi)參；B.DP處理24 h后，提取分析線(xiàn)粒體蛋白，Western分析蛋白表達(dá)。圖4 DP對(duì)線(xiàn)粒體蛋白表達(dá)和定位的影響

4 討論

近年來(lái)，從中草藥中尋找安全有效的腫瘤化療替代藥物成為研究的熱點(diǎn)之一。乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開(kāi)始一直呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。已知血竭素高氯酸鹽(DP)對(duì)人宮頸癌具有抗腫瘤效果[3]，本課題研究DP的抗婦科癌癥乳腺癌效果。研究發(fā)現(xiàn)DP可以有效的抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)凋亡方式促進(jìn)細(xì)胞的死亡。說(shuō)明DP可以成為潛在的抗乳腺癌藥物。

線(xiàn)粒體途徑是細(xì)胞凋亡通路之一。當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位降低的時(shí)候，細(xì)胞內(nèi)的AIF和cytochrome C 會(huì)從線(xiàn)粒體內(nèi)釋放出來(lái)，促進(jìn)pro-caspase-9剪切活化為caspase-9，進(jìn)而促進(jìn)caspase-3的活化。我們研究發(fā)現(xiàn)DP降低線(xiàn)粒體膜電位，并促進(jìn)caspase-9的活化，說(shuō)明DP攻擊細(xì)胞的線(xiàn)粒體來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MCF-7細(xì)胞是caspase-3缺失的細(xì)胞[7]，所以caspase-9的作用無(wú)法傳遞給下游的caspase-3，但我們同樣觀察到了PARP表達(dá)降低、細(xì)胞核皺縮、DNA片段化、凋亡小體出現(xiàn)等凋亡現(xiàn)象，說(shuō)明DP對(duì)caspase-3缺失的細(xì)胞仍具有促進(jìn)其凋亡的作用，而DP可能活化caspase-3以外的凋亡因子，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

線(xiàn)粒體膜電位降低的主要原因是線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白表達(dá)以及分布改變。Bax和Bak等線(xiàn)粒體蛋白以同源二聚體形式存在時(shí)，會(huì)在線(xiàn)粒體上打孔來(lái)降低線(xiàn)粒體膜電位。而B(niǎo)cl-2和Bcl-XL等線(xiàn)粒體蛋白以同源二聚體形式存在時(shí)，會(huì)穩(wěn)定線(xiàn)粒體的膜電位[6]。我們研究發(fā)現(xiàn)DP處理后，Bcl-2的表達(dá)降低，而B(niǎo)ax表達(dá)增加，但Bak和Bcl-XL表達(dá)沒(méi)有明顯的改變，說(shuō)明DP可以調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白表達(dá)。同樣我們通過(guò)提取線(xiàn)粒體蛋白觀察了他們?cè)诰€(xiàn)粒體的分布，研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體的Bax和Bak表達(dá)增多，而B(niǎo)cl-2和Bcl-XL表達(dá)減少。這樣Bcl-2和Bcl-XL穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位的作用被Bax和Bak抑制了。說(shuō)明DP可以調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白定位來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

總之，DP通過(guò)改變線(xiàn)粒體膜電位來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，DP具有抗乳腺癌作用，是潛在的抗乳腺癌藥物。

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DracorhodinPerchlorateInducedHumanBreastCancerMCF-7CellApoptosisthroughMitochondrialPathway

WANGYing1，LIULetian1，YANGLiu1，WANGHaiyan2*

(1.DepartmentofGastroenterology，TheFirstHospitalofJilinUniversity，JilinUniversity，Changchun130000，China；2.Nursingdepartment，TheFirstHospitalofJilinUniversity，JilinUniversity，Changchun130000，China)

Objective：To investigate the anti-tumor effect and the mechanism of Dracorhodin perchlorate(DP)in human breast cancer MCF-7.Methods：The inhibitory rate of60μmol·L-1DP to tumor cell was measured by MTT analysis. Cell morphology analysis，nuclear morphology analysis，and DNA fragmentation test were applied for detecting apoptosis. Rhodamine123staining was used for mitochondrial membrane potential(MMP). Western blot was applied for protein expression.Results：60μmol·L-1DP inhibited MCF-7growth in time-dependent manner，and the inhibition of DP resulted from apoptosis. The caspase-9was activated when DP induced apoptosis，and PAR Pexpression was decreased after DP treatment. The decreased MMP led to apoptosis(in control group93.11% cells kept normal MMP，but in DP-treated group only37.45% kept normal MMP). Mitochondrial Bcl-2and Bcl-XL were decreased，and Bax and Bak were increased，which led to decreased MMP in MCF-7cells.Conclusion：DP induced apoptosis through mitochondrial pathways.

Dracorhodin perchlorate；apoptosis；mitochondrial protein

*

王海燕，主管護(hù)師，研究方向：腫瘤治療與癌癥患者護(hù)理；Tel：(0431)88783436，E-mail：422321732@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.008

2015-03-10)