成人表皮干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)

陳甫寰，宋慧鋒，岳曉彤，劉玲英，王統(tǒng)民，何秀葉

（解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形五病區(qū)北京100048）

·基礎(chǔ)研究·

成人表皮干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)

陳甫寰，宋慧鋒，岳曉彤，劉玲英，王統(tǒng)民，何秀葉

（解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形五病區(qū)北京100048）

背景：人表皮干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定，為探討人表皮干細(xì)胞再生汗腺的可行性打下基礎(chǔ)。目的：探討體外分離培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞及汗腺細(xì)胞的有效方法。方法：采集不同年齡段的泌尿外科患者術(shù)后包皮組織，充分清洗消毒后去除皮下組織，將其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片，用Ⅳ型膠原純化、富集成人表皮干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：使用免疫熒光染色對(duì)成人表皮干細(xì)胞表型進(jìn)行分析；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)；采用膠原酶消化法從人全層無(wú)損傷皮膚中分離提取汗腺細(xì)胞，并進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定。結(jié)果：倒置相差顯微鏡下見(jiàn)分離培養(yǎng)的成人表皮干細(xì)胞呈卵圓形、細(xì)胞之間緊密相連，呈鋪路石狀，免疫熒光染色顯示細(xì)胞表達(dá)CK19、β1整合素。倒置相差顯微鏡下見(jiàn)汗腺細(xì)胞呈扁平多角形，表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)志細(xì)胞CK7、18、19及CEA。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明膠原酶消化法分離培養(yǎng)成人表皮干細(xì)胞及汗腺樣細(xì)胞是可行的。

汗腺細(xì)胞；表皮干細(xì)胞；培養(yǎng)；分離；鑒定

干細(xì)胞及組織工程學(xué)科最近幾年的發(fā)展，為大面積燒、創(chuàng)傷患者的修復(fù)開(kāi)辟了新的途徑。2006年，Moore KA和Lemischka IR等人［1］發(fā)現(xiàn)：表皮干細(xì)胞（Epidermal Stem Cells，ESCs）來(lái)源于胚胎的外胚層，是屬于皮膚的一種專(zhuān)能干細(xì)胞，也是一種成年組織的干細(xì)胞，其增殖和分化成表皮中各種細(xì)胞的能力維持著皮膚正常表皮結(jié)構(gòu)，并且可以在一定誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出胚胎干細(xì)胞性能的雙向分化能力，是一種潛在的多能干細(xì)胞，對(duì)于組織工程學(xué)科而言是很有前景的一種細(xì)胞。

皮膚作為人體面積最大的器官，擔(dān)負(fù)著非常重要的生理功能，對(duì)于整形外科大夫而言，一個(gè)完整并且具有功能的皮膚對(duì)于維持外觀也是有著十分重要的作用。然而燒、創(chuàng)以及戰(zhàn)傷中，皮膚是首當(dāng)其沖被損壞的器官。嚴(yán)重的皮膚損傷會(huì)導(dǎo)致皮膚附屬器損傷后再生困難，然而汗腺作為皮膚重要的附屬器官之一，對(duì)于機(jī)體有著分泌和排泄汗液，而且可調(diào)節(jié)體溫的功能；缺失汗腺等附屬器的瘢痕組織則很難完成這一任務(wù)，因而導(dǎo)致燒、創(chuàng)以及戰(zhàn)傷的患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，也伴隨著生理及心理的嚴(yán)重障礙。因此如何有效地在體外培養(yǎng)人汗腺細(xì)胞對(duì)于從細(xì)胞水平深入研究汗腺的結(jié)構(gòu)和功能有著重大的意義，并且也為后期的表皮干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究成人表皮干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞（Sweat Gland cells；SGCs）的體外分離培養(yǎng)和增值及鑒定，可為觀察ESCs和SGCs共培養(yǎng)前后細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型改變；探討ESCs再生SGCs的可行性提供前提條件并且打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1設(shè)計(jì)與取材

2014年10月-2015年3月，在解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的體外觀察及鑒定實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本選自無(wú)損傷全層成人正常皮膚及不同年齡段成人包皮，分別由解放軍總醫(yī)院第304臨床部燒傷整形五病區(qū)及泌尿外科門(mén)診提供，均取得患者知情同意。

1.2主要試劑及材料

DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco公司），F(xiàn)BS（Gibco公司），PBS，青霉素/鏈霉素/倆性霉素B三抗（美國(guó)PAA公司）、胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、K-SFM培養(yǎng)基，重組人表皮生長(zhǎng)因子（rh-EGF）、Dispase酶（Gibco公司），Ⅳ型膠原（美國(guó)Sigma公司）；Ⅱ型膠原酶；β1整合素（β1-integrin）受體單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），CK19受體單克隆抗體，癌胚抗原（CEA）單克隆抗體，倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、離心機(jī)（日本Kubota公司）。生物凈化工作臺(tái)（北京偉達(dá)凈化研究所）。

1.3方法

1.3.1成人表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：包皮組織碘伏浸泡5～10min，酒精脫碘。紫外線(xiàn)滅菌工作臺(tái)上利用無(wú)菌外科手術(shù)器械去除皮下組織。將剩余組織修剪出1cm×1cm大小的皮片，Dispase酶4℃避光消化12～14h后分離表皮和真皮層，盡可能的剪碎表皮，0.125%的胰蛋白酶（內(nèi)含0.04%EDTA）37℃消化10～15min。加入完全培養(yǎng)液終止消化，仔細(xì)吹打。200目篩網(wǎng)過(guò)濾。濾液通過(guò)離心機(jī)（1 300r/min離心5min），棄去上清液，收集細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)后決定重懸細(xì)胞的培養(yǎng)基量，加入適當(dāng)K-SFM培養(yǎng)基并且緩慢吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先使用Ⅳ型膠原鋪板的六孔板中，恒溫箱孵育過(guò)夜，24h后換液。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3d換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合到70%時(shí)傳代。

1.3.2成人表皮干細(xì)胞鑒定：β1整合素和CK19免疫熒光染色法鑒定：將2代ESCs接種于96孔板中培育24h，用PBS洗滌細(xì)胞3次后，4%多聚甲醛固定40min，PBS清洗3次；加入0.3%Triton進(jìn)行通透化處理；正常山羊血清封閉30min后，傾倒。免洗，加入稀釋后的一抗，4℃過(guò)夜。隔日使用PBS清洗后加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記二抗，避光孵育30min。使用倒置熒光顯微鏡拍照記錄。

1.3.3 CCK-8檢測(cè)ESCs增殖：分離成人的ESCs，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ESCs；胰酶消化，離心后，棄去上清，制作細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，分別于1、2、3、4、5、6、7d相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出一個(gè)培養(yǎng)板，相應(yīng)制作空白對(duì)照組，每孔加入CCK-8溶液10μl，培養(yǎng)3h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度（A）值，根據(jù)A450nm值繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

1.3.4汗腺細(xì)胞的分離培養(yǎng)：將全層無(wú)損傷正常全層皮膚，置于PBS中反復(fù)漂洗，去除皮下脂肪、血管及肌肉等組織，在25mm2培養(yǎng)皿中將皮膚剪成1mm×1mm左右的組織塊，加入內(nèi)皮消化液3ml，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜（約10～12h），次日，在紫外線(xiàn)消毒的倒置相差顯微鏡（50×）下挑取汗腺組織，放置在PBS中清洗汗腺組織，10min后再次挑選出汗腺組織，放置在汗腺培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)。汗腺培養(yǎng)基汗腺培養(yǎng)基以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，配以體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、15μg/L重組人表皮生長(zhǎng)因子、4μg/L三碘甲狀腺原氨酸、0.5mg/L半琥珀酰氫化可的松、體積分?jǐn)?shù)5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉及100U/ml三抗。2～3d，等待汗腺組織貼壁后，補(bǔ)加1～1.5ml汗腺培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4d換1次培養(yǎng)基。

1.3.5去除混雜的成纖維細(xì)胞：培養(yǎng)SGCs過(guò)程中，如挑選汗腺組織的過(guò)程中PBS清洗不徹底，少量成纖維細(xì)胞混雜生長(zhǎng)，需及時(shí)去除混雜的成纖維細(xì)胞，否則影響SGCs的生長(zhǎng)；采用低濃度的胰蛋白酶（0.05%）消化成纖維細(xì)胞，純化汗腺細(xì)胞，步驟為：PBS洗2次，6孔板中加入2～3ml的0.05%胰蛋白酶，隨時(shí)在倒置相差顯微鏡觀察，當(dāng)成纖維細(xì)胞開(kāi)始收縮變圓至脫落，加入內(nèi)皮完培終止消化，仔細(xì)吹打事先標(biāo)記的成纖維細(xì)胞區(qū)域，PBS沖洗3次，加入1.5ml汗腺培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6汗腺細(xì)胞的免疫熒光鑒定：CK7、CK18、CK19和CEA免疫熒光染色法鑒定：將1代SGCs接種于事先放置有載玻片的6孔板中培育24h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定40min，PBS清洗3次；0.3%Triton通透化處理；正常山羊血清封閉30min，傾倒。免洗，加入稀釋后的一抗，4℃過(guò)夜。隔日，PBS清洗后加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記二抗，避光孵育30min。倒置熒光顯微鏡拍照記錄。

1.4主要觀察指標(biāo)

培養(yǎng)的ESCs和汗腺細(xì)胞的形態(tài)及鑒定結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本之間比較采用組間t檢驗(yàn)，以Sig=0.000＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1A2　4h時(shí)表皮干細(xì)胞還未貼壁，呈圓盤(pán)透亮化（100×）

圖1B　3d后，表皮干細(xì)胞開(kāi)始貼壁（100×）

圖1C　10d后，表皮干細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)六孔板（100×）

圖1D　第5代表皮干細(xì)胞開(kāi)始分化、衰老，形態(tài)相差大（200×）

2　結(jié)果

2.1分離培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞的形態(tài)

倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，采用酶消法分離細(xì)胞，Ⅳ型膠原酶篩選法培養(yǎng)的人表皮干下細(xì)胞，培養(yǎng)24h開(kāi)始貼壁（圖1A），呈卵圓形且透亮。換液后可以發(fā)現(xiàn)部分未貼壁漂浮細(xì)胞被沖洗掉，其余的細(xì)胞3d后基本全部貼壁生長(zhǎng)（圖1B），10d左右長(zhǎng)滿(mǎn)六孔板約80%（圖1C）。細(xì)胞之間連接緊密，呈鋪路石狀。繼續(xù)培養(yǎng)，克隆逐漸擴(kuò)大部分中央會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)。傳代后生長(zhǎng)速度極為迅速，一般5d左右便可以傳代一次，到第五代時(shí)表皮干細(xì)胞開(kāi)始衰老死亡（圖1D）。

圖2　表皮干細(xì)胞CCK-8增殖曲線(xiàn)

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)組增殖曲線(xiàn)（圖2）近似S形。細(xì)胞接種后1～2d處于潛伏期，第3天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖生長(zhǎng)，第7天達(dá)到高峰，而第6天生長(zhǎng)不明顯，細(xì)胞在96孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)板的速度明顯快于六孔板，第7天達(dá)到高峰。

從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)講，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)量的sig0.000小于0.05，所以拒絕了方差相等的假設(shè)。t檢驗(yàn)中，雙側(cè)sig值0.000小于0.05，因此，在0.05置信度水平時(shí)，可認(rèn)為兩者存在顯著性差異。因此，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組（表1、表2）。

2.3表皮干細(xì)胞免疫熒光表型結(jié)果

第三代的人表皮干細(xì)胞熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：β1整合素、p63和CK19強(qiáng)烈表達(dá)（圖3A～C）。符合表皮干細(xì)胞表面標(biāo)記物，證明所分離培養(yǎng)細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。

2.4分離培養(yǎng)汗腺細(xì)胞形態(tài)

Ⅱ型膠原酶消化剪碎的皮膚組織，可見(jiàn)汗腺組織游離，呈盤(pán)曲狀（圖4A），消化過(guò)度的汗腺組織則呈顆粒狀（圖4F）。細(xì)胞接種于六孔板，2～3d可見(jiàn)貼壁的汗腺組織，并且向外生長(zhǎng)汗腺細(xì)胞（圖4B），培養(yǎng)汗腺細(xì)胞的期間有成纖維細(xì)胞妨礙汗腺細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4C）。汗腺細(xì)胞從游離的完整汗腺組織中生長(zhǎng)，呈多邊形，持續(xù)分裂2周，部分細(xì)胞可在后期依然保持分裂能力，在原有的細(xì)胞基礎(chǔ)上持續(xù)生長(zhǎng)，可疊加生長(zhǎng)，出現(xiàn)類(lèi)似鋪路石樣改變（圖4D）。

培養(yǎng)汗腺細(xì)胞的過(guò)程中，顯微鏡下可以觀察到有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的上皮細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)其特有的“Dome”結(jié)構(gòu)形成［2］（圖4G），其形成可能與腺上皮液體跨膜運(yùn)輸有關(guān)。培養(yǎng)4周左右，汗腺細(xì)胞顯示衰老，細(xì)胞空泡樣變并且停止繼續(xù)分裂生長(zhǎng)（圖4E）。

2.5汗腺細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)組所培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)CEA，符合汗腺細(xì)胞的表面標(biāo)記物，且CK7、CK18、CK19也有明顯表達(dá)（圖5A～D）。

表1　SPSS組間比較結(jié)果

表2　獨(dú)立樣本檢驗(yàn)

圖3A　β-integrin（200X）

圖3B　p63（200X）

圖3C　CK19（200X）

圖4A　汗腺組織團(tuán)塊（50×）

圖4B　2d后開(kāi)始貼壁，SGCs向外生長(zhǎng)（100×）

圖4C　培養(yǎng)10d后發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞混雜生長(zhǎng)（100×）

圖4D　15后SGCs長(zhǎng)滿(mǎn)六孔板（100×）

圖4E　衰老的SGCs（100×）

圖4F　消化過(guò)度的汗腺組織（100×）

圖4G　“Dome”結(jié)構(gòu)（200×）

圖5A　CK7（200×）

圖5B　CK18（200×）

圖5C　CEA（200×）

圖5D　CK19（200×）

3　討論

3.1成人ESCs的分離培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)成人表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)基成分、種植細(xì)胞的密度、培養(yǎng)的溫度以及Ⅳ型膠原鋪板濃度的掌握，對(duì)于其體外增殖和分化特性可產(chǎn)生很大的影響。就ESCs而言，隨著年齡的不斷增長(zhǎng)，人體ESCs的含量也會(huì)隨著減少，同時(shí)也會(huì)集中于表皮隆突部或者真皮乳頭頂部的基底層內(nèi)，這有可能是兒童皮膚損傷修復(fù)能力強(qiáng)于成人的生理依據(jù)之一［3］。因此，將體內(nèi)的表皮干細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，顯得十分重要。本實(shí)驗(yàn)采用了胰酶消化、高濃度Ⅳ型膠原篩選法提取ESCs。傳代時(shí)所需時(shí)間減少，降低了多次離心對(duì)細(xì)胞的損傷和丟失等特點(diǎn)。

在表皮干細(xì)胞研究中，發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞的標(biāo)記物種類(lèi)非常之多，但目前應(yīng)用最多的則為β1整合素、CK19、p63等［4］，ESCs的β1-整合素表達(dá)水平是短暫擴(kuò)增細(xì)胞的2倍，由此判斷β1-integrin可作為ESCs的表面標(biāo)記物之一［5］。ESCs表達(dá)CK19與CK15［6］，但CK15表達(dá)減少較早出現(xiàn)，因此認(rèn)為CK15和CD34是毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志物［7］，毛囊根鞘膨隆凸部存在CK19陽(yáng)性細(xì)胞，也是ESCs存在的部位，并且CK19陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)高度表達(dá)α3β1整合素；這些都可以證明CK19是ESCs的另一個(gè)重要標(biāo)記物。還有一種可能成為ESCs表面標(biāo)記物的是p63，維持ESCs生物特性及增殖分化中起決定性的作用［8］。

3.2汗腺細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)增殖和鑒定

以前一般采用組織塊培養(yǎng)法來(lái)取得SGCs［9］，但其生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、傳代困難并且摻雜成纖維細(xì)胞污染SGC問(wèn)題嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)利用‖型膠原酶消化法，通過(guò)顯微鏡觀察汗腺組織，微量移液器吸取汗腺的方法來(lái)分離培養(yǎng)汗腺細(xì)胞，但仍需注意以下問(wèn)題：①選擇汗腺豐富的全層無(wú)損傷正常皮膚組織如雙手、雙腳以及額部皮膚等；②皮膚漂洗的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，消毒液濃度不宜太高；這些都是導(dǎo)致汗腺質(zhì)量下降的原因；③Ⅱ型膠原酶使用濃度及其消化時(shí)間：加入含有Ⅱ型膠原酶（2g/L）消化過(guò)夜，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，10～12h為宜；④汗腺組織貼壁時(shí)添加培養(yǎng)基量：初始汗腺培養(yǎng)基添加過(guò)少，不能提供足夠的濕度和營(yíng)養(yǎng)；過(guò)多，挑取的汗腺漂浮其中無(wú)法貼壁，初始六孔板中加入600～800μl汗腺培養(yǎng)基為宜；⑤皮膚組織處理大?。浩つw離體24h內(nèi)，無(wú)菌手術(shù)器械反復(fù)剪碎新鮮皮膚組織，1mm×1mm大小為宜，過(guò)大不利于汗腺游離，過(guò)小則易消化過(guò)度，導(dǎo)致其崩解（圖D6）；⑥隨時(shí)嚴(yán)密觀察汗腺游離情況；⑦使用微量移液器挑取汗腺時(shí)，先放入事先準(zhǔn)備的PBS中，每挑取一個(gè)汗腺置于其中洗滌，盡可能去除混有的成纖維細(xì)胞以及多余的‖型膠原酶，然后接種于六孔板中，盡可能避免細(xì)胞污染。

目前對(duì)汗腺細(xì)胞表面標(biāo)志物缺乏特異且排他性的表面標(biāo)志物［10-15］。但CEA、CK19、CK18以及CK7對(duì)于汗腺細(xì)胞有著重要的意義［16-18］，因此本實(shí)驗(yàn)組通過(guò)這四個(gè)標(biāo)記物來(lái)證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為汗腺細(xì)胞，而不是皮膚組織中的其他上皮細(xì)胞。

表皮干細(xì)胞作為皮膚組織中的專(zhuān)能干細(xì)胞，既可通過(guò)遷移分化成為表皮基底層，進(jìn)一部生成汗腺、毛囊等皮膚附屬器官，又可通過(guò)最終分化成為各種表皮細(xì)胞［19］，適宜用作皮膚組織工程的種子細(xì)胞。表皮干細(xì)胞具有體內(nèi)周期慢以保證其巨大的增殖潛能及減少DNA復(fù)制時(shí)的出錯(cuò)幾率，且數(shù)量相對(duì)稀少［20］，因此體外分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞顯得至關(guān)重要。

干細(xì)胞壁龕學(xué)說(shuō)認(rèn)為：干細(xì)胞所處微環(huán)境有較好的誘導(dǎo)分化作用。干細(xì)胞進(jìn)入某種特定的微環(huán)境后，其分化信號(hào)會(huì)有反應(yīng)并且已分化細(xì)胞也會(huì)對(duì)其他未分化細(xì)胞有影響，導(dǎo)致其向某些特定細(xì)胞分化［21］。干細(xì)胞壁龕學(xué)說(shuō)對(duì)于定義細(xì)胞種類(lèi)、特定調(diào)控因子及其細(xì)胞間的作用有著開(kāi)創(chuàng)性的框架作用，并且處于生理狀態(tài)下的干細(xì)胞的壁龕對(duì)于組織的損害修復(fù)，老化以及疾病的進(jìn)展目前了解甚少，主要是因?yàn)轶w內(nèi)環(huán)境的特殊性，微環(huán)境誘導(dǎo)的具體機(jī)制及其基因水平的調(diào)控等各方面尚不明確，多種因素都對(duì)于干細(xì)胞的分化均有可能有作用，體內(nèi)微環(huán)境的改變是很難實(shí)現(xiàn)的，但體外模擬體內(nèi)微環(huán)境是可行的；由此誘導(dǎo)干細(xì)胞體外分化的研究成為熱門(mén)。采取的方法主要有用目的細(xì)胞培養(yǎng)的上清液誘導(dǎo)和與目的細(xì)胞共培養(yǎng)兩種方式。因此體外分離培養(yǎng)SGCs和ESCs，誘導(dǎo)增殖能力強(qiáng)、具有多種分化能力潛能并且免疫原性低的ESCs分化為汗腺細(xì)胞等皮膚附屬器相關(guān)細(xì)胞，為建造一個(gè)理想的組織工程皮膚有著很大的幫助。

人工構(gòu)建包含皮膚附屬器的組織工程皮膚是最終發(fā)展的方向，由于皮膚損傷導(dǎo)致的皮膚附屬器缺失的患者，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降；選擇免疫原性低且包含功能的人工皮膚對(duì)于嚴(yán)重?zé)?、?chuàng)以及戰(zhàn)傷的患者而言是十分重要且迫切的。因此構(gòu)建可再生皮膚附屬器的種子細(xì)胞就顯得十分重要。筆者實(shí)驗(yàn)組認(rèn)為：ESCs可作為汗腺組織工程種子細(xì)胞的重要來(lái)源，前期的分離培養(yǎng)ESCs及SGCs為以后繼續(xù)探索和闡明ESCs向SGCs分化的機(jī)制做出有力鋪墊，也為進(jìn)一步研究提供了有力條件。

［1］Moore KA，Lemischka IR.Stem cells and their niches［J］. Science，2006，311（5769）：1880-1885.

［2］JiangT，KumbarSG，NairLS，etal.Biologicallyactive chitosan systems for tissue engineering and regenerative medicine［J］.Curr Top Med Chem，2008，8（4）：354-364.

［3］董蕊，金巖，劉源，等.表皮干細(xì)胞在成人及胎兒不同部位皮膚中的比較研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（18）：1640-1642.

［4］王聯(lián)群，藍(lán)蔚，黃培信，等.IV型膠原快速黏附法體外分選人胎兒表皮干細(xì)胞［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（43）：8535-8538.

［5］Inoue K，Aoi N，Sato T，et al.Differential expression of stemcell-associated markers in human hair follicle epithelial cells［J］.Lab Invest，2009，89（8）：844-856.

［6］孫曉燕，付小兵.表皮干細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.感染、炎癥、修復(fù)，2008，9（1）：52-54.

［7］Nanashima N，Ito K，Ishikawa T，et al.Damage of hair follicle stem cells and alteration of keratin expression in external radiation-induced acute alopecia［J］.Int JMol Med，2012，30（3）：579-584.

［8］Suzuki D，Senoo M.Increased p63 Phosphorylation marks early transition of epidermal stem cells to progenitors［J］.J Invest Dermatol，2012，132（10）：2461-2464.

［9］Zhuang Y，Chen X，Xu M，et al.Chemo kine stromal cellderivedfactor1/CXCL12increaseshomingof mesenchymalstemcellstoinjuredmyocardiumand neovascularization following myocardial infarction［J］.Chin Med J，2009，122（2）：183-187.

［10］蔡颯，潘宇，趙安東.不同劑量PDGF-BB凝膠劑促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35（10）：1201-1203.

［11］Li HH，Zhou G，F(xiàn)u XB，et al.Antigen expression of human eccrine sweat glands［J］.Pifu Binglixue Zazhi，2009，36（3）：318-324.

［12］Li H，F(xiàn)u X，Zhang L，et al.Research of PDGF-BB gel on the wound healing of diabetic rats and its pharmacodynamics［J］.Surg Res，2008，145：41-48.

［13］Sheng ZY，F(xiàn)u XB，Cai S，et al.Regeneration of functional sweat gland-like structures by transplanted differentiated bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Chuangshang Huifu Yu Zaisheng，2009，17（3）：427-435.

［14］SilvaGV，LitovskyS，AssadJA，etal.Mesenchymalstemcells differentiate into an endothelial phenotype，enhance vascular density，and improve heart function in a canine chronic ischemiamodel［J］.Circulation，2005，111（2）：150-156.

［15］Buchanan JA，Yeger H，Tabcharani JA，et al.Transformed sweat gland and nasal epithelial cell lines from control and cystic fibrosis individuals［J］.Cell Sci，1990，95（Pt）：109-123.

［16］Li TS，Komota T，Ohshima M，et al.TGF-beta induces the differentiation of bone marrow stem cells into immature cardiomyocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366（4）：1074-1080.

［17］HashemiSM，GhodsS，KolodgieFD，etal.Aplacebo controlled，dose-ranging，safetystudyofallogenic mesenchymalstemcellsinjectedbyendomyocardial delivery after an acute myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2008，29（2）：251-259.

［18］Li L，Zhang ZY，Lin HY，et al.Combined transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and pedicled greater omentum promotes locomotor function and regeneration of axons after spinal cord injury in rats［J］.Neural Regen Res，2008，3（4）：358-362.

［19］Charruyer A，Ghadially R.What’s new in dermatology：epidermal stem cells［J］.GItal Dermatol Venereol，2011，146（1）：57-67.

［20］Jeans SM，Lowell S，Hutter C.Epidermal stem cells［J］.J Pathol，2002，197（4）：479-491.

［21］Voog J，Jones DL.Stem cells and the niche：a dynamic duo［J］.Cell Stem Cell，2010，6（2）：103-115.

編輯/張惠娟

Isolation and culture of human epidermal stem cells and sweat gland cells in vitro

CHEN Fu-huan，SONG Hui-feng，YUE Xiao-tong，LIU Ling-ying，WANG Tong-min，HE Xiu-ye
（The Fifth Ward of Burn and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital，Beijing 100048，China）

Background Research on the culture and identification of human Epidermal Stem Cells（ESCs）and Sweat Gland Cells（SGCs）In vitro，Which can provide the foundation for the feasibility of Epidermal Stem Cells（ESCs）to regenerate Sweat Gland.Objective To study the effective method on isolation and culture of sweat gland cells（SGCS）and human Epidermal Stem Cell（ESCs）in vitro. Methods Foreskin tissue with different ages were collected by Urology Department，after being fully cleaned and disinfected，we removed the subcutaneous tissue；then We trimmed left tissue to 0.5cm× 0.5cm size；with the help ofⅣcollagen to purify and enrich adult's Epidermal stem cells（ESCs）. EpidermalStemCells'formwereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope: Immunofluorescence staining to analysis adult's epidermal stem cells'phenotype；CCK-8 was used to detect proliferation curve；We used collagenase digestion to isolate sweat gland from intact skin，and than amplified and identified Sweat Gland Cells（SGCs）.ResultsUsing inverted phase contrast microscope to observe isolated adult Epidermal Stem Cells，finding out that Epidermal Stem Cells were cultured like oval，and closely linked among each other，like cobblestone；Immunofluorescence stain was used to find that Epidermal Stem Cells expressed CK19，β1-integrin.We observed that Sweat Gland Cells were cultured like flat polygonal and expressing markers like CK7，CK18，CK19 and CEA.Conclusion In a word，it is feasible to separate and culture Epidermal Stem Cells with adherent method and Sweat Gland Cells with collagenase digestion method.

Sweat Gland Cells（SGCs）；Epidermal Stem Cells（ESCs）；culture；isolation；identification

Q813.1

A

1008-6455（2015）14-0036-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81171821）

宋慧鋒，主任醫(yī)師；主要研究方向：美容整形、瘢痕整形以及組織工程等；E-mail:song_huifeng@126.com

2015-05-02

2015-06-29