白假絲酵母菌突變株ORF19．2500的功能研究

牛理達(dá)　陳曉慶　趙靜　吳建華　鄭慶虎（．上海長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科，上海004；．上海大學(xué)，上海0046；．解放軍5醫(yī)院皮膚科，鄭州45004）

白假絲酵母菌突變株ORF19．2500的功能研究

牛理達(dá)1陳曉慶2趙靜1吳建華1鄭慶虎3
（1．上海長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科，上海200433；2．上海大學(xué)，上海200436；3．解放軍153醫(yī)院皮膚科，鄭州450042）

目的篩選50株白假絲酵母菌基因缺失菌，尋找出對(duì)白假絲酵母菌生物被膜形成相關(guān)基因，進(jìn)一步探究白假絲酵母菌生物膜的致病機(jī)制。方法利用培養(yǎng)生物被膜的方法篩選50株基因缺失菌；利用XTT法驗(yàn)證所篩選出的白假絲酵母菌突變株ORF19．2500生物被膜形成缺陷；進(jìn)一步觀察ORF19．2500基因缺失菌生長(zhǎng)、菌絲形成。結(jié)果用XTT法證明白假絲酵母菌突變株orf19．2500生物膜形成缺陷，且生長(zhǎng)曲線和滴瓊脂平板的方法均提示其生長(zhǎng)速率減慢。在spider培養(yǎng)基上白假絲酵母菌突變株orf19．2500不能誘導(dǎo)菌絲形成，但在YPD＋10%小牛血清則菌絲形成正常。結(jié)論白假絲酵母菌突變株orf19．2500可利用spider培養(yǎng)基缺陷而影響其酵母、菌絲二態(tài)性的轉(zhuǎn)化，及其生物被膜的形成。

白假絲酵母菌；orf19．2500；酵母；菌絲；生物膜

［Chin J Mycol，2015，10（2）：70?74］

近年來，隨著免疫缺陷宿主的不斷增多，深部真菌感染在臨床上大幅上升，已成為免疫功能低下患者死亡的主要原因之一，白假絲酵母菌是人體常見的條件致病菌之一，是深部真菌感染的首要病原菌，占醫(yī)院內(nèi)微生物感染的第4位［1］。研究發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌生物被膜的形成使致病力明顯增加，尤其一些體內(nèi)移植物和塑膠制品如義齒、導(dǎo)尿管放置的患者，白假絲酵母菌很容易在其表面形成有孢子、酵母、假菌絲和細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的三維立體結(jié)構(gòu)，不僅增加真菌的侵襲性，而且使其抗藥性明顯增加，因此對(duì)白假絲酵母菌生物被膜的深入研究成為我們目前了解真菌致病機(jī)制和研究抗真菌藥物的重點(diǎn)［2］。該實(shí)驗(yàn)利用spider培養(yǎng)基和10%小牛血清孵育的方法，可體外誘導(dǎo)生物被膜形成［3］的方法對(duì)50株白假絲酵母菌基因缺失株進(jìn)行篩選，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌突變株orf19．2500生物被膜形成缺陷，通過考察其生長(zhǎng)、菌絲形成，試圖闡明白假絲酵母菌突變株orf19．2500的功能及影響生物被膜形成的分子機(jī)制。

1　材料和方法

1．1材料

菌株來源采用白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SN250和50株白假絲酵母菌突變菌株由上海中科院巴斯德所陳昌斌教授饋贈(zèng)。

主要試劑小牛血清（sigma公司），XTT（Sigama公司），YPD培養(yǎng)基（yeast?peptone?dex?trose medium）、YPD液體培養(yǎng)基、spider培養(yǎng)基及PBS溶液，XTT粉末和甲萘醌粉末根據(jù)文獻(xiàn)配制和保存。

1．2方法

白假絲酵母菌突變菌株庫的篩選將凍存于?80℃的菌株解凍于YPD瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇、分離純化，挑取單菌落將其轉(zhuǎn)種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖床，200r／min，培養(yǎng)過夜；將12孔培養(yǎng)皿（Nest Biotech Co，Ltd）中分別加入1mL 10%的小牛血清（Sigma，corporation），37℃搖床，200r／min，孵育過夜；將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌懸液，用spider培養(yǎng)基稀釋成菌濃度為1×107cells／mL，在37℃搖床，200r／min，培養(yǎng)90min后（黏附階段），棄去未黏附的懸浮細(xì)胞，用1mL PBS溶液洗1次，加入2mL新鮮的spider培養(yǎng)基，37℃搖床，200r／min，培養(yǎng)48 h，肉眼評(píng)估打分篩選出生物膜生長(zhǎng)明顯受限的白念珠菌突變菌株［3］。

基因敲除菌的驗(yàn)證將凍存于?80℃的菌株解凍與YPD瓊脂培養(yǎng)基上，選取6個(gè)orf19．2500的單菌落，1個(gè)SN250的單菌落，挑菌于含有15μL的zymolase的PCR管中，充分混勻，放入PCR儀，調(diào)整程序?yàn)?7℃15min，95℃10min，最終為10℃，而后加入135μL的PCR dd H2O稀釋10倍，充分混勻后，取出兩排8聯(lián)PCR管，1～7號(hào)加入2μL CBO178＋179的引物，9～14號(hào)加入2μL CBO542＋543的引物，7和14號(hào)管加入稀釋后5μL SN250的底物，8號(hào)管加PCR 5μL dd H2O，其余管內(nèi)加入的是稀釋后的5μL orf19．2500的底物，然后每個(gè)管內(nèi)依次加入10×Tag buffer 5μL，2．5 mM dNTP mix 4μL，Tag酶0．5μL，dd H2O 33．5μL，然后充分混勻，放入PCR儀中擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5min，94℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，72℃10min，最終降為10℃延伸，重復(fù)此循環(huán)30次，該步驟由Noble SM實(shí)驗(yàn)室提供。

XTT法［4］檢測(cè)白假絲酵母菌突變株orf19．2500對(duì)生物膜形成的影響接種處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的兩種菌，用spider培養(yǎng)基稀釋成1×106Cellss／mL，分別取100μL稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌SN250加入96孔培養(yǎng)板的A1?A5號(hào)孔內(nèi)中，基因缺失株加入A7?A12號(hào)孔內(nèi)，B1?B5孔加入不含菌液的spider培養(yǎng)基作為對(duì)照，37℃搖床，200 rmp／min，培養(yǎng)90min（黏附階段）后棄去上清液，PBS洗滌3次，再次加100μL spider培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，棄上清，PBS洗滌3次，每孔加入100μL 0．5 g／L的XTT和1 μmmol／L的甲萘醌溶液，避光37℃，靜止培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在490 nm波長(zhǎng)處的A值。將5個(gè)獨(dú)立孔的A值進(jìn)行平均，利用ANOVA來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0．05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　本研究所用基因敲除菌驗(yàn)證的引物及其序列Tab．1　Primers used for verifyication the disruption of target genes

生長(zhǎng)情況的測(cè)定將過夜培養(yǎng)的白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株SN250，突變株orf19．2500，用YPD液體培養(yǎng)基稀釋成菌濃度為2×106cells／mL，1．5 h后測(cè)OD600值，而后每2 h測(cè)1次OD值，連續(xù)12 h繪制出生長(zhǎng)曲線［5］，對(duì)比他們之間的生長(zhǎng)的變化。接種過夜培養(yǎng)的白念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)株SN250和突變株，將三種菌的菌懸液分別稀釋至100、10?1、10?2、10?3（細(xì)胞濃度由1×107cells／mL至1×104cells／mL），接種于YPD瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，對(duì)比他們?cè)赮PD瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。

誘導(dǎo)菌絲形成接種處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的兩種菌用spider培養(yǎng)基和YPD＋10%小牛血清稀釋成菌濃度為1×107cells／mL，取5mL加入試管中，37℃搖床，200 r／min，分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h后，取出10μL加入載玻片，再加蓋玻片，光學(xué)顯微鏡觀察菌絲誘導(dǎo)情況。

2　結(jié)　果

2．1基因缺失株的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示（見圖1），目的基因已經(jīng)成功敲除，白假絲酵母菌突變株orf19．2500構(gòu)建成功。

2．2利用XTT法證明白假絲酵母菌突變株orf19．2500生物膜形成缺陷

在肉眼條件下，可見到白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SN250形成的生物膜能基本覆蓋一個(gè)完整的培養(yǎng)皿，而突變株orf19．2500肉眼幾乎看不到有培養(yǎng)皿上有生物膜形成（見圖2），提示突變株orf19．2500不能很好地利用spider培養(yǎng)基，而使生物膜形成缺陷；同時(shí)利用XTT法進(jìn)一步證實(shí)突變株orf19．2500在spider培養(yǎng)基上形成生物膜的能力差，兩者比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．3白假絲酵母菌突變株orf19．2500的生長(zhǎng)缺陷

在YPD培養(yǎng)基上，100、10?1、10?2、10?3不同菌懸液濃度梯度上均可以看出突變株orf19．2500的生長(zhǎng)缺陷；同時(shí)我們利用YPD液體培養(yǎng)基繪制生長(zhǎng)曲線的方法證實(shí)了突變株orf19．2500的生長(zhǎng)缺陷，白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Y250的倍增時(shí)間大概是1．5 h，而突變株orf19．2500倍增時(shí)間大概是3．5 h（見圖3）。

2．4白假絲酵母菌突變株orf19．2500在spider和YPD＋10%小牛血清培養(yǎng)基上的菌絲形成

在光學(xué)顯微鏡下，可以觀察到白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SN250，在spider和YPD＋10%小牛血清上2 h起即有菌絲形成，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)形成菌絲的數(shù)量逐漸增加，且長(zhǎng)度也在增加；而突變株orf19．2500在spider培養(yǎng)基上一直以酵母相出現(xiàn)，但是在YPD＋10%小牛血清上則是和標(biāo)準(zhǔn)菌株SN250一樣始終是以菌絲態(tài)存在（見圖4）。

3　討　論

白假絲酵母菌是一種共生的真菌，主要存在于腸道黏膜和泌尿生殖道黏膜表面，對(duì)于大部分人來說它是良性存在的，但是當(dāng)機(jī)體的免疫功能和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)受到損害，白假絲酵母菌感染就變成可能。大部分白假絲酵母菌感染的產(chǎn)生是由于它具有產(chǎn)生生物膜的能力［6］。生物被膜常常存在于移植物的表面，與感染相伴隨，因而具有重要的臨床意義。

對(duì)白假絲酵母菌生物膜的研究成為抗真菌治療的關(guān)鍵，我們利用體外培養(yǎng)生物膜的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的50個(gè)基因的突變株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)ORF19．2500形成生物膜的能力明顯下降，利用白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫尋找，發(fā)現(xiàn)對(duì)該基因的功能研究甚少，僅推測(cè)一些區(qū)域具有轉(zhuǎn)移酶的活性且與生物合成相關(guān)［7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中該基因缺失株在spider培養(yǎng)基上生物膜形成缺陷。白假絲酵母菌的生物膜的形成分四個(gè)階段：第一階段為白假絲酵母菌的黏附階段，一般發(fā)生于黏附初期的90～120min，第二階段為白假絲酵母菌為增殖和定向出芽生殖階段，該階段中白假絲酵母菌形成大量的菌絲和假菌絲；第三階段為白假絲酵母菌細(xì)胞外基質(zhì)形成階段，使生物膜形成一個(gè)三維立體結(jié)構(gòu)，是白假絲酵母菌生物膜發(fā)揮耐藥機(jī)制的主要階段；第四個(gè)階段為生物膜的中孢子向外周擴(kuò)散［8］?；蛉笔е闛RF19．2500在spider培養(yǎng)基中2 h、4 h、6 h均以酵母態(tài)存在，而在YPD＋10%小牛血清中能成功誘導(dǎo)出菌絲，在這四個(gè)階段中白假絲酵母菌定向出芽生殖形成假菌絲和菌絲的階段是最重要的階段，研究表明使菌絲形成受限的基因缺失株很難構(gòu)成完整的生物膜。由圖2、4可見，該基因利用spider培養(yǎng)基受限制，不能誘導(dǎo)其正常的出芽生殖從而使其生物膜形成明顯缺陷。那么對(duì)白假絲酵母菌突變株orf19．2500在spider培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生物膜形成時(shí)，一些菌絲相關(guān)基因如ECE1、HWP1、ALS3、Hyr1及其誘導(dǎo)菌絲形成的信號(hào)通路［9］的表達(dá)情況是我們下一步研究的重點(diǎn)。

我們利用白假絲酵母菌數(shù)據(jù)庫尋找突變株ORF19．2500基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因的保守序列與ERG9的保守序列相似，通過尋找白假絲酵母菌中ERG9的功能發(fā)現(xiàn)，該基因同樣具有spider培養(yǎng)基利用缺陷［10］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ERG9介導(dǎo)白假絲酵母菌麥角固醇合成途徑［11］，因此對(duì)該白假絲酵母菌突變菌ORF19．2500的功能可進(jìn)行進(jìn)一步探討。

白假絲酵母菌突變株0RF19．2500除了具有生長(zhǎng)緩慢的功能外，在spider培養(yǎng)基上還可明顯地利用缺陷進(jìn)而影響其酵母、菌絲二態(tài)性的轉(zhuǎn)化和生物膜的形成，豐富了該未知基因的功能。

致謝：上海中科院巴斯德研究所陳昌斌教授饋贈(zèng)白假絲酵母菌突變株ORF19．2500。

圖1　白假絲酵母菌突變株基因組DNA的PCR驗(yàn)證　圖2　a．標(biāo)準(zhǔn)菌株SN250的生物膜，b．突變株orf19．2500的生物膜，c．XTT法比較標(biāo)準(zhǔn)菌株SN250和突變株orf19．2500生物膜形成差異　圖3　a．白假絲酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)株Y250（a）和突變株orf19．2500，接種于YPD瓊脂培養(yǎng)基中，不同濃度梯度的生長(zhǎng)情況；b．標(biāo)準(zhǔn)株SN250和突變株orf19．2500的生長(zhǎng)曲線　圖4　標(biāo)準(zhǔn)株SN250和orf19．2500在液體菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在培養(yǎng)2 h、4 h、6 h的菌絲形成能力Fig．1　PCR analysisi confirming Candida albican mutant orf19．2500　Fig．2　a．The biofilm of wild?type Y250，b．The biofilm of mutant orf19．2500，c．XTT analysis of the biofilm in wild?type Y250 and mutant orf19．2500　Fig．3　a．The wild?type SN250 and mutant orf19．2500 were spotted in 4?fold di?lutions（from 1×107cells／mL to 1×104cells／mL）onto yeast extract peptone dextrose（YPD）plates；b．Time?growth curve of C．a(chǎn)lbicans wild?type SN250 and mutant orf19．2500　Fig．4　C．a(chǎn)lbicans with wild?type SN250 and the mutant orf19．2500 were grown in liquid spider and YPD plus 10% fetal bovine serum media at 37℃for 2 h，4 h，6 h，and then photographed（Bar＝100 μm）

［1］Noble SM，F(xiàn)rench S，Kohn LA，et al．Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morpho?genetic switching and pathogenicity［J］．Nat Genet，2010，42（7）：590?598．

［2］ten CJM，Klis FM，Pereira?Cenci T，et al．Molecular and cellular mechanisms that lead to Candida biofilm formation［J］．J Dent Res，2009，88（2）：105?115．

［3］Nobile CJ，F(xiàn)ox EP，Nett JE，et al．A recently evolved transcrip?tional network controls biofilm development in Candida albicans［J］．Cell，2012，148（1?2）：126?138．

［4］Li DD，Zhao LX，Mylonakis E，et al．In vitro and in vivo activities of pterostilbene against Candida albicans biofilms［J］．Antimi?crob Agents Chemother，2014，58（4）：2344?2355．

［5］Tan X，F(xiàn)uchs BB，Wang Y，et al．The role of Candida albicans SPT20 in filamentation，biofilm formation and pathogenesis［J］．PLoS One，2014，9（4）：e94468．

［6］Mayer FL，Wilson D，Hube B．Candida albicans pathogenicity mechanisms［J］．Virulence，2013，4（2）：119?128．

［7］Maglott D，Ostell J，Pruitt KD，et al．Entrez Gene：gene?centered information at NCB［J］I．Nucleic Acids Res，2007，35（Databaseissue）：D26?31．

［8］Sardi JC，Pitangui NS，Rodriguez?Arellanes G，et al．Fusco?Almeida AM，Mendes?Giannini MJ．Highlights in pathogenic fun?gal biofilms［J］．Rev Iberoam Micol，2014，31（1）：22?29．

［9］Fan Y，He H，Dong Y，et al．Hyphae?specific genes HGC1，ALS3，HWP1，and ECE1 and relevant signaling pathways in Candida albicans［J］．Mycopathologia，2013，176（5?6）：329?335．

［10］Nobile CJ，F(xiàn)ox EP，Nett JE，et al．A recently evolved transcrip? tional network controls biofilm development in Candida albicans［J］．Cell，2012，148（1?2）：126?138．

［11］Liu TT，Lee RE，Barker KS，et al．Genome?wide expression profi?ling of the response to azole，polyene，echinocandin，and pyrimi?dine antifungal agents in Candida albicans［J］．Antimicrob A?gents Chemother，2005，49（6）：2226?2236．

［本文編輯］王飛

A study of function in Candida albicans mutant ORF19．2500

NIU Li?da1，CHEN Xiao?qing2，ZHAO Jing1，WU Jian?hua1，ZHENG Qing?hu3
（1．Department of Dermatology，Changhai hospital，Shanghai，200433；2．ShangHai University，Shanghai，200436；3．PLA 153 Central Hospital，Zhengzhou，450042）

ObjectiveFor searching some genes which impacted the formation of Candida albicans biofilm．Then we screened of 50 Candida albicans mutants．So as to identify potential pathogen mechanism of Candida albicans．MethodsScreening 50 Candida albicans mutants in the method of cultivating biofilm in vivo．Biofilm was quantified by XTT．Then the mutants of growth rate and hy?phal formation were analyzed．ResultsIt was defected for Candida albicans mutant orf19．2500 to form biofilm which was quantified by XTT．The mutant grows slowly，which was quantified by growth curve and spot assay．Then we find the mutant can not form hyphal in liquid spider media，while it can normally form hyphal in liquid YPD plus 10%fetal bovine serum media．ConclusionThe Candi?da albicans mutant orf19．2500 can not utilize liquid media which impacted morphogenetic switching and the biofilm formation．

Candida albicans；orf19．2500；yeast；hyphal；biofilm

R 379．4

A

1673?3827（2015）10?0070?05

國家973項(xiàng)目（2013CB31602）

牛理達(dá)，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：15721571136＠126．com

吳建華，E?mail：wujh＿ch＠163．com；鄭慶虎，E?mail：zhengqinghu205＠163．com

2014?12?02