細胞凋亡在維生素　K2抑制高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化中的作用

白亞玲，徐金升，張睦清，張勝雷，張俊霞，崔立文，張慧然

細胞凋亡在維生素K2抑制高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化中的作用

白亞玲，徐金升，張睦清，張勝雷，張俊霞，崔立文，張慧然

目的 探討維生素K2對高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）鈣化的影響及細胞凋亡在其中所起的作用。方法 選取8～10周齡健康雄性SD大鼠6只，分別體外分離培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，采用免疫細胞化學方法鑒定。將VSMCs采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、高磷組、維生素K2組1（10 μmol/L）、維生素K2組2（25 μmol/L）及維生素K2組3（50 μmol/L）。檢測VSMCs鈣含量、Axl mRNA和Bcl-2 mRNA表達、細胞凋亡率。結果 5組大鼠VSMCs鈣含量比較，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。高磷組、維生素 K2組1、維生素 K2組2、維生素 K2組3均高于正常對照組（P＜0.05）；維生素K2組1、維生素K2組2、維生素K2組3均低于高磷組（P＜0.05）；維生素K2組2、維生素K2組3均低于維生素K2組1（P＜0.05）；維生素K2組3低于維生素K2組2（P＜0.05）。5組大鼠VSMCs中Axl mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高磷組、維生素K2組1 Axl mRNA表達水平低于正常對照組，維生素K2組3 Axl mRNA表達水平高于正常對照組，維生素K2組2、維生素K2組3 Axl mRNA表達水平高于高磷組（P＜0.05）。5組大鼠VSMCs中Bcl-2 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。5組大鼠細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高磷組、維生素K2組1細胞凋亡率高于正常對照組，維生素 K2組1、維生素K2組2、維生素K2組3細胞凋亡率低于高磷組（P＜0.05）。結論 維生素K2能夠抑制高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化，其機制可能是通過上調生長停滯特異基因6（Gas6）/Axl的表達而抑制了VSMCs的凋亡。

肌細胞，平滑?。痪S生素K2；血管鈣化；細胞凋亡；大鼠

白亞玲，徐金升，張睦清，等.細胞凋亡在維生素K2抑制高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化中的作用［J］.中國全科醫(yī)學，2015，18（3）：278-282.［www.chinagp.net］

Bai YL，Xu JS，Zhang MQ，et al.Effects of cell apoptosis on high-phosphorus-induced rat vascular smooth muscle cells calcification inhibited by vitamin K2［J］.Chinese General Practice，2015，18（3）：278-282.

研究表明，心血管鈣化是終末期腎?。‥SRD）患者死亡的重要預測因素［1］。血管鈣化是鈣化抑制分子和誘導分子間失衡引起的一種主動調控過程［2］。透析患者的血管鈣化主要發(fā)生在動脈中膜，血管平滑肌細胞的凋亡是血管中膜發(fā)生鈣化的主要機制之一［3］。據(jù)報道，有半數(shù)以上的透析患者存在維生素K2缺乏［4-6］，維生素K2的缺乏程度和血管鈣化的嚴重程度呈正相關［5］，且維生素K2拮抗劑 （vitamin K antagonist，VKA）的應用與大動脈鈣化OR值的升高相關。動物實驗證實，補充維生素K2可以抑制血管中膜鈣化［7］。但是維生素K2抑制血管鈣化是否與抗凋亡作用有關，目前尚不清楚。為此，本研究以高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）為模型，觀察維生素K2對細胞凋亡及鈣化的影響。

1　材料與方法

1.1材料 選取8～10周齡健康雄性SD大鼠6只，體質量80～100 g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2儀器與試劑 維生素K2（美國GIBCO）、鼠抗鼠Runx2單克隆抗體（英國ABCAM公司）、酶標儀 （HT2型，奧地利Anthos公司）、倒置相差顯微鏡 （LH50A型，日本OLYMPUS公司）、10%胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司）、DMEM培養(yǎng)基 （美國GIBCO公司）、SP免疫組化試劑盒（上海博海生物工程）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋股份有限公司）。

1.3研究方法

1.3.1大鼠VSMCs原代培養(yǎng)及分組 采用簡單隨機抽樣法選取2只大鼠分別用戊巴比妥鈉麻醉后用75%乙醇浸泡，在無菌條件下分離出胸主動脈，剝去外膜，縱向剪開管壁，然后用紗布輕輕擦除內膜，將中膜剪成1 cm ×1 cm×1 cm左右的小塊，放入2個培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液2 ml，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液。此后每隔2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，直至細胞80%～90%融合時進行傳代。此后每隔 3～4 d傳代 1次，最終得到20瓶VSMCs。將VSMCs采用隨機數(shù)字表編號，分為正常對照組、高磷組、維生素K2組1（10 μmol/L）、維生素K2組2（25 μmol/L）及維生素 K2組3（50 μmol/L）。正常對照組采用含10%胎牛血清2 ml培養(yǎng)，高磷組采用高磷培養(yǎng)基 （10 mmol/L β-甘油磷酸2 ml）培養(yǎng)，各維生素K2組在高磷培養(yǎng)基的基礎上分別加入10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L維生素K2各2 ml，每2 d換液1次。將剩余4只大鼠按照上述方法培養(yǎng)，重復2次。

1.3.2細胞鑒定 應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、排列方式及生長特點等。免疫細胞化學染色6孔板內用消毒的蓋玻片制作細胞爬片，待細胞貼壁生長至60% ～70%時，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1～2次，爬片用95%乙醇固定30 min，PBS洗滌2次，2 min/次，加入平滑肌肌動蛋白抗體（α-SMA actin）（1∶100稀釋），37℃孵育30 min后滴加鏈親和素生物素復合物（SABC），37℃孵育20 min，PBS洗滌4次，5 min/次。DAB顯色，蘇木素輕度復染，經(jīng)分化，脫水，透明，封片，在顯微鏡下觀察。

1.3.3鈣化檢測

1.3.3.1茜素紅染色 取3代細胞接種于12孔板內，各組給予不同處理因素后，于實驗第14天用細胞茜素紅鈣染色試劑對樣本進行固定、染色及澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結節(jié)染色情況，每組選取3個樣本，每個樣本隨機選取 1個視野（×100）。十二烷基硫酸鈉（SDS）結果判斷標準［8］：鈣鹽沉積為橘紅色。

1.3.3.2鈣含量測定 取3代細胞以5×104/孔密度接種于12孔板，14 d后，細胞用鹽酸脫鈣取上清液，鈣定量檢測試劑盒測定鈣含量，脫鈣后的細胞用0.1 mol/ L NaOH和0.1%SDS溶解30 min。BCA法測定細胞蛋白含量。細胞鈣含量/蛋白含量（mg/g蛋白）為細胞內鈣含量。各組設3個復孔，取均值。

1.4反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）觀察維生素K2對VSMCs中Axl mRNA和Bcl-2 mRNA表達的影響采用RNA分離試劑盒Trizol提取并純化組織總RNA。PCR在ABI5700型PCR儀上進行，反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、55℃退火30 s、58℃延伸45 s（共 35個循環(huán)），最后 72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物，行瓊脂糖凝膠電泳，應用RT-PCR進行檢測，重復3次。以GAPDH作為內對照，計算Axl mRNA 和Bcl-2 mRNA相對含量?；驍U增引物序列見表1。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率 0.25%胰酶消化收集各組細胞，PBS洗滌2次，將細胞重懸于70%乙醇中固定24 h，后加入適量PI染液混勻，室溫靜置15 min后放入流式細胞儀。亞G1期即為凋亡期細胞。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1細胞鑒定 倒置顯微鏡下可見大鼠胸主動脈組織塊貼壁3～4 d后細胞從組織塊邊緣爬出，細胞為長梭形，呈束狀排列；5～6 d成同心圓狀細胞團，形成明顯的細胞生長暈，并圍繞組織塊邊緣呈束狀向外呈放射狀延伸；6～7 d后細胞融合成片，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質向外伸出2～3個長短不等的突起，中有卵圓形核，相互重疊生長，呈典型的“峰-谷”樣表現(xiàn)。用α-SMA actin進行免疫細胞化學法檢測可見：細胞質表達強陽性。傳代純化，細胞生長特性未見異常改變。

2.2維生素K2對高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化的影響第14天時茜素紅染色結果顯示，高磷組的橘紅色礦化結節(jié)明顯多于正常對照組；與高磷組相比，各維生素K2組的橘紅色礦化結節(jié)減少，且隨維生素K2水平的增高，橘紅色礦化結節(jié)越來越少（見圖1）。5組大鼠VSMCs鈣含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高磷組、維生素K2組1、維生素K2組2、維生素 K2組3均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；維生素K2組1、維生素K2組2、維生素K2組3均低于高磷組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；維生素 K2組2、維生素K2組3均低于維生素K2組1，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；維生素K2組3低于維生素K2組2，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05，見表2）。

2.3維生素K2對高磷誘導的大鼠 VSMCs中Axl mRNA 及Bcl-2 mRNA表達的影響 5組大鼠 VSMCs中 Axl mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高磷組、維生素K2組1 Axl mRNA表達水平低于正常對照組，維生素K2組3 Axl mRNA表達水平高于正常對照組，維生素K2組2、維生素K2組3 Axl mRNA表達水平高于高磷組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。5組大鼠VSMCs中Bcl-2 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05，見表3）。

表1　基因引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 Gene primer sequence

表2　5組大鼠　VSMCs鈣含量的比較?。ā纒，mg/g蛋白）Table 2 Comparison of calcium content of rat VSMCs among five groups

表2　5組大鼠　VSMCs鈣含量的比較?。ā纒，mg/g蛋白）Table 2 Comparison of calcium content of rat VSMCs among five groups

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與高磷組比較，△P＜0.05；與維生素K2組1比較，▲P＜0.05；與維生素K2組2比較，○P＜0.05

11.5±2.8高磷組　82.9±9.9*維生素K2組1　74.3±9.1*△維生素K2組2　49.9±6.5*△▲維生素K2組3　24.4±3.3*△▲○F值正常對照組＜0.001 175.212 P值組別　鈣含量

圖1　大鼠VSMCs顯微鏡下鈣鹽沉積?。ㄜ缢丶t染色，×100）Figure 1 Deposition of calcium salts in VSMCs rats under microscope

2.4維生素K2對高磷誘導的大鼠細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測5組大鼠細胞凋亡率見圖2。5組大鼠細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高磷組、維生素K2組1細胞凋亡率高于正常對照組，維生素K2組1、維生素K2組2、維生素K2組3細胞凋亡率低于高磷組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表4）。

表3　5組大鼠VSMCs中　Axl mRNA和　Bcl-2 mRNA表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of Axl and Bcl-2 mRNA expression of rat VSMCs among five groups

表3　5組大鼠VSMCs中　Axl mRNA和　Bcl-2 mRNA表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of Axl and Bcl-2 mRNA expression of rat VSMCs among five groups

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與高磷組比較，▲P＜0.05

組別1.29±0.17　1.12±0.40高磷組　0.64±0.14*　0.98±0.45維生素　K2組1　0.76±0.14*　1.16±0.43維生素　K2組2　1.42±0.23▲　1.21±0.38維生素　K2組　3　1.61±0.32*▲　1.24±0.41 F值Axl mRNA　Bcl-2 mRNA正常對照組＜0.001　0.892 23.960　0.368 P值

圖2　流式細胞儀檢測各組大鼠細胞凋亡率Figure 2 VSMCs apoptosis rate of the rats tested by flow cytometry

表4　5組大鼠細胞凋亡率比較（±s，%）Table 4 Comparison of apoptosis rate of rat VSMCs among five groups

表4　5組大鼠細胞凋亡率比較（±s，%）Table 4 Comparison of apoptosis rate of rat VSMCs among five groups

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與高磷組比較，△P＜0.05

2.3±1.1高磷組　10.5±1.5*維生素K2組1　7.6±1.5*△維生素K2組2　4.6±1.6△維生素K2組3　3.5±1.3△F值組別　細胞凋亡率正常對照組＜0.001 16.570 P值

3　討論

維生素K均是2-甲基-1，4-萘醌的衍生物。廣泛存在于自然界的維生素有K1和K2。維生素K1又稱植物甲萘醌或葉綠醌，主要存在于深綠色蔬菜和植物油中。維生素K2是腸道細菌的產(chǎn)物。在透析患者中，各種類型的維生素K均低于正常人［9］，其中維生素K2攝入與血管鈣化的關系顯示，嚴重的血管鈣化與維生素K2攝入量呈負相關，而維生素K1與血管鈣化并無相關性［10］，提示維生素K2比維生素K1在血管鈣化中起著更重要的作用。維生素K2的缺乏出現(xiàn)在動脈鈣化的透析患者中比例顯著升高，回歸分析顯示維生素K2缺乏發(fā)生與血管鈣化相關［9］，且慢性腎臟?。–KD）狀態(tài)很可能由于維生素K2利用障礙，進而導致血管鈣化增加［7］，所以本實驗選用維生素 K2刺激細胞，觀察其對高磷誘導的大鼠VSMCs鈣化的影響。通過茜素紅染色、鈣含量的測定，本研究發(fā)現(xiàn)高磷組、維生素K2組1、維生素K2組2、維生素K2組3均高于正常對照組，維生素K2組1、維生素K2組2、維生素K2組3均低于高磷組，維生素K2組2、維生素K2組3均低于維生素K2組1，維生素K2組3低于維生素K2組2。提示高磷可以促進血管鈣化，而維生素K2可以抑制高磷誘導的血管鈣化，并呈濃度依賴性。

細胞凋亡是血管鈣化主要發(fā)生機制之一，CKD患者體內鈣磷代謝紊亂，主要為高磷血癥，研究表明高磷血癥可誘導磷酸鈣晶體產(chǎn)生［11］，而磷酸鈣晶體在人主動脈平滑肌細胞中可通過迅速升高細胞內鈣水平引起程序性細胞死亡［12］；小型磷酸鈣晶體被血管細胞吞噬，通過溶酶體酸化作用降解，引起細胞內鈣水平升高，最終導致細胞凋亡。凋亡的細胞形成凋亡小體，這些凋亡小體可作為基質礦化的成核位點從而啟動鈣化過程［8］。采用半胱天冬酶抑制劑可抑制凋亡，減少鈣化。本研究發(fā)現(xiàn)，高磷組、維生素K2組1細胞凋亡率高于正常對照組，維生素K2組2、維生素K2組3細胞凋亡率低于高磷組，提示高磷可促進細胞凋亡，而維生素K2可起到抗凋亡的保護作用，維生素K2是通過抑制凋亡從而抑制了VSMCs的鈣化。

鈣磷促進細胞凋亡的機制可能是通過下調生長停滯特異基因6（Gas6）/Axl信號通路，這種信號通路具有防止細胞凋亡的保護作用［13］，而Gas6的活化主要是其N端的谷氨酸（Glu）變?yōu)棣?羧基谷氨酸（Gla），而這一羧基化過程是維生素K依賴的。本研究結果發(fā)現(xiàn)，當補充維生素K2后，尤其是維生素K2水平超過25 μmol/L后，其受體Axl mRNA的表達水平升高，提示維生素K2可上調Gas6/Axl，使其發(fā)揮更強的抗凋亡作用。當Axl激活后，可進一步刺激抗凋亡基因Bcl-2的表達，最終使細胞壽命延長［14］，本研究中各組Bcl-2 mRNA表達水平間無差異，其原因可能是Gas6/Axl可上調磷酸化的Bcl-2，而不影響總Bcl-2的表達［15］。

綜上所述，本研究結果表明維生素K2可抑制高磷誘導的大鼠VSMCs的鈣化，其機制可能是通過上調Gas6/Axl的表達而抑制了VSMCs的凋亡。上述結果進一步證實了維生素K2水平與CKD患者的血管鈣化相關，而當補充維生素K2后，可抑制血管鈣化的發(fā)生；同時為維生素K2抑制血管鈣化的分子機制和臨床應用提供新的實驗依據(jù)。但本研究只從一方面探究了維生素K2抑制血管鈣化的機制，且其是否可減少CKD患者的血管鈣化尚有待臨床試驗進一步證實。

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（本文編輯：李婷婷）

Effects of Cell Apoptosis on High-phosphorus-induced Rat Vascular Smooth Muscle Cells Calcification Inhibited byVitamin K2

BAI Ya-ling，XU Jin-sheng，ZHANG Mu-qing，et al.Department of Nephrology，the Forth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

Objective To explore the effects of vitamin K2on high-phosphorus-induced calcification of rat vascular smooth muscle cells（VSMCs），and the role played by cell apoptosis.Methods A total of 6 healthy female SD rats aged 8-10 weeks were selected，VSMCs from rat thoracic aorta were cultured in vitro，and identified by immunocytochemistry.VSMCs were randomly divided into 5 groups by random number table method：control group，high phosphorus group，vitamin K2group 1（10 μmol/L），vitamin K2group 2（25 μmol/L），vitamin K2group 3（50 μmol/L）.The cell calcium content，the expression of Axl and Bcl-2 mRNA，and the cell apoptosis rate were measured.Results There was significant difference in calcium content of VSMCs among 5 groups of rats（P＜0.05）.The VSMCs calcium level in high phosphorus group，vitamin K2group 1，vitamin K2group 2，vitamin K2group 3 was significantly higher than that in control group，respectively（P＜0.05）.The VSMCs calcium level in vitamin K2group 1，vitamin K2group 2，vitamin K2group 3 was significantly lower than that in high phosphorus group，respectively（P＜0.05）.The VSMCs calcium level in vitamin K2group 2，vitamin K2group 3 was significantly lower than that in vitamin K2group 1，respectively（P＜0.05）.The VSMCs calcium level in vitamin K2group 3 was significantly lower than that in vitamin K2group 2（P＜0.05）.There was significant difference in the expression level of Axl mRNA inVSMCs among 5 groups of rats（P＜0.05）.The expression level of VSMCs Axl mRNA in high phosphorus group and in vitamin K2group 1 was significantly lower than that in control group，respectively（P＜0.05）.The expression level of VSMCs Axl mRNA in vitamin K2group 3 was significantly higher than that in control group（P＜0.05）.The expression level of VSMCs Axl mRNA in vitamin K2group 2 and in vitamin K2group 3 was significantly higher than that in high phosphorus group，respectively （P＜0.05）.There was no significant difference in the expression level of Bcl-2 mRNA in VSMCs among 5 groups of rats（P＞0.05）.There was significant difference in VSMCs apoptosis rate among 5 groups of rats（P＜0.05）.The VSMCs apoptosis rate in high phosphorus group and in vitamin K2group 1 was significantly higher than that in control group，the VSMCs apoptosis rate in vitamin K2group 1，in vitamin K2group 2 and in vitamin K2group 3 was significantly lower than that in high phosphorus group，respectively（P＜0.05）.Conclusion Vitamin K2can inhibit high-phosphorus-induced calcification of rat VSMCs，may alleviate VSMCs apoptosis by increasing Gas6/Axl expression，the mechanism is probably that vitamin K2may alleviate VSMCs apoptosis by increasing Gas6/Axl expression.

Myocytes，smooth muscle；Vitamin K2；Vascular calcification；Apoptosis；Rats

R 543

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.03.010

河北省自然科學基金資助項目（H2012206157）

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腎內科

徐金升，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腎內科；E-mail：xjs5766@126.com

2014-09-21；

2014-12-01）