阿司匹林和氯吡格雷對(duì)體外血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響及其機(jī)制研究

朱晉坤，毛　華，尹揚(yáng)光，董　文，杜　峰，魯玉明，熊宗華，鄧夢(mèng)揚(yáng)

阿司匹林和氯吡格雷對(duì)體外血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響及其機(jī)制研究

朱晉坤，毛華，尹揚(yáng)光，董文，杜峰，魯玉明，熊宗華，鄧夢(mèng)揚(yáng)

目的 體外研究阿司匹林和氯吡格雷對(duì)血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響及其機(jī)制，從理論上尋找兩種藥物聯(lián)合效果優(yōu)于單藥的原因。方法 于2013年在第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)健康雌性SD大鼠42只，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將SD大鼠分為阿司匹林組（8只）、氯吡格雷組 （8只）、阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷組 （聯(lián)合組，8只）、對(duì)照組（8只）以及用于原代細(xì)胞分離培養(yǎng)10只。分離培養(yǎng)原代大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用50 μg/ml氧化修飾低密度脂蛋白（ox-LDL）建立受損血管內(nèi)皮細(xì)胞模型并采用100 mg/kg阿司匹林、10 mg/kg氯吡格雷、100 mg/kg阿司匹林聯(lián)合10 mg/kg氯吡格雷以及200 μl蓖麻油制作內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)板；血漿血小板分離制備前3 d，阿司匹林組喂養(yǎng)阿司匹林100 mg·kg-1·d-1，氯吡格雷組喂養(yǎng)氯吡格雷10 mg·kg-1·d-1，聯(lián)合組喂養(yǎng)阿司匹林100 mg·kg-1·d-1，氯吡格雷10 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組喂養(yǎng)蓖麻油200 μl/d。采用ELISA法檢測(cè)黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)上的血小板數(shù)量；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)阿司匹林和氯吡格雷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）、氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1）、CD40表達(dá)的影響。結(jié)果 經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的血小板對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附活性的影響：4組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中氯吡格雷組和聯(lián)合組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性均低于對(duì)照組和阿司匹林組，阿司匹林組150 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性低于對(duì)照組（P＜0.05）。血小板黏附經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響：4組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），其中聯(lián)合組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性分別低于對(duì)照組、阿司匹林組和氯吡格雷組（P＜0.05）。蛋白質(zhì)免疫印跡法顯示，阿司匹林和氯吡格雷均能抑制由 ox-LDL引起的TM表達(dá)的減少。ox-LDL能明顯誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1表達(dá)，阿司匹林能明顯抑制由ox-LDL引起的LOX-1和IL-6的表達(dá)；而氯吡格雷則能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞CD40的表達(dá)。結(jié)論 阿司匹林和氯吡格雷均能從上調(diào)TM和抑制炎性因子兩方面降低血小板對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的黏附作用。但兩者聯(lián)合更能抑制由ox-LDL引起的炎性因子的表達(dá)，降低血小板對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的黏附。

氯吡格雷；阿司匹林；血小板；內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)

朱晉坤，毛華，尹揚(yáng)光，等.阿司匹林和氯吡格雷對(duì)體外血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響及其機(jī)制研究［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18（3）：283-287.［www.chinagp.net］

Zhu JK，Mao H，Yin YG，et al.Effects of aspirin and clopidogrel on the adhesion activity of platelet to endothelial cell Matrix in vitro and its mechanism［J］.Chinese General Practice，2015，18（3）：283-287.

冠狀動(dòng)脈支架植入或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）手術(shù)成功的關(guān)鍵是能否有效抑制血栓的形成，所以冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后支架內(nèi)血栓形成和內(nèi)皮化是目前亟待解決的問(wèn)題。血小板在整個(gè)血栓形成和血管內(nèi)皮化進(jìn)程中起著重要的作用［1］。所以，臨床上主要采用針對(duì)血小板的治療抑制血栓形成，防治因血栓堆積造成的內(nèi)皮化不良。

氯吡格雷是一種二磷腺苷 （ADP）受體阻滯劑，可與血小板膜表面ADP受體結(jié)合，使纖維蛋白原無(wú)法與血小板表面特異糖蛋白GPⅡb/Ⅲa（αⅡb、β3、CD41/ CD61）受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集［2］。有研究證實(shí)，單純采用氯吡格雷治療血栓的療效并不顯著，而且容易產(chǎn)生氯吡格雷抵抗［3］。阿司匹林通過(guò)抑制環(huán)氧合酶1（COX-1），抑制花生四烯酸向血栓素A2（TXA2）轉(zhuǎn)化，從而抑制血栓素對(duì)血小板的激活作用［4］。低劑量的阿司匹林在體內(nèi)有療效聚集效應(yīng)，因此是治療血栓形成的良好藥物，但部分女性患者對(duì)阿司匹林不敏感［5］。阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合治療血栓能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，并能減少患者出血現(xiàn)象，是目前冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)治療［6］。本研究通過(guò)體外研究阿司匹林和氯吡格雷對(duì)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料 于2013年在第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)健康雌性SD大鼠42只，體質(zhì)量250～300 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將SD大鼠分為阿司匹林組（8只）、氯吡格雷組（8只）、阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷組（聯(lián)合組，8只）、對(duì)照組（8只）以及用于原代細(xì)胞分離培養(yǎng)10只。

1.2原代細(xì)胞分離培養(yǎng) 處死SD大鼠，75%乙醇浸泡1 min，超凈臺(tái)上打開(kāi)腹腔，暴露心臟；用無(wú)菌眼科剪在右心房處剪口，5 ml注射器穿刺左心室，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗主動(dòng)脈；完整分離主動(dòng)脈，并盡量分離脂肪、肌肉等其他組織。將分離的主動(dòng)脈放入無(wú)菌平皿中，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基沖洗。用眼科剪將血管剪開(kāi)，把血管面貼向孔板，滴加少量培養(yǎng)基〔含10%胎牛血清（Life technology，美國(guó)）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素 （hyclone，美國(guó)）的DMEM培養(yǎng)基（Life technology，美國(guó)）〕，待組織塊貼牢固后每孔輕微加入剛沒(méi)入組織塊的上述培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度中培養(yǎng)，待細(xì)胞不再溢出后用胰酶消化分瓶。

1.3鼠血漿血小板分離制備 取血前3 d，阿司匹林組喂養(yǎng)阿司匹林100 mg·kg-1·d-1，氯吡格雷組喂養(yǎng)氯吡格雷10 mg·kg-1·d-1，聯(lián)合組喂養(yǎng)阿司匹林100 mg ·kg-1·d-1和氯吡格雷10 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組喂養(yǎng)蓖麻油200 μl/d。富血小板血漿 （PRP）制備：斷尾取SD大鼠靜脈血保存于含32 g/L的枸櫞酸鈉真空管中，混勻，靜置15 min后在1 500 r/min的離心機(jī)中常溫離心15 min，離心半徑10 cm，小心吸取上層血漿于4℃保存。用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（LC-170CRP，日本）計(jì)數(shù)每個(gè)樣本的血小板數(shù)，并記錄。貧血小板血漿（PPP）制備：將上述樣本在3 000 r/min的離心機(jī)中常溫離心5 min，小心吸取上層血漿，作為PPP。用制備好的PPP調(diào)整PRP的血小板數(shù)至1×106個(gè)/μl，于4℃保存。

1.4血管損傷模型內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)板制備 內(nèi)皮細(xì)胞胞外基質(zhì)的制備依據(jù)參考文獻(xiàn)［2］。內(nèi)皮細(xì)胞種植于96孔板中，培養(yǎng)時(shí)添加5%葡聚糖，待細(xì)胞密度達(dá)85%時(shí)，50 μg/ml氧化修飾低密度脂蛋白 （ox-LDL）處理24 h，同時(shí)，采用100 mg/kg阿司匹林、10 mg/kg氯吡格雷、100 mg/kg阿司匹林聯(lián)合10 mg/kg氯吡格雷以及200 μl蓖麻油處理內(nèi)皮細(xì)胞后移除培養(yǎng)基，每孔用0.5%Triton-X100-PBS溶液100 μl處理細(xì)胞30 min，無(wú)菌PBS清洗，100 μl 0.025 mol/L NH4OH清除細(xì)胞核后，100 μl無(wú)菌PBS清洗孔板3次，于4℃封存。

1.5血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì) 血小板黏附活性檢測(cè)依據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，以?xún)?nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)包被的96孔板作為ELISA孔板，按照CD41/CD61-ELISA試劑盒 （酶聯(lián)生物科技有限公司，上海）說(shuō)明書(shū)操作，將0、50、100、150、200 μl蓖麻油或經(jīng)處理后的PRP加入制作好的ELISA孔板中，室溫下放置1 h，PBS洗去未凝集的血小板，加入CD41抗體，37℃孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的抗體，加入顯色液，在酶標(biāo)儀中450 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡 收集內(nèi)皮細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白水平檢測(cè)試劑盒和分光光度計(jì)測(cè)定蛋白水平，并加入十二烷基磺酸鈉（SDS）上樣緩沖液備用。將總蛋白30 μg在10%聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中進(jìn)行分離，每個(gè)樣本至少用3塊平行膠進(jìn)行分離。通過(guò)“三明治”濕法轉(zhuǎn)印將已經(jīng)分離好的蛋白轉(zhuǎn)印于預(yù)先活化好的聚偏氟乙烯（PVDF）膜（merck-millipore，美國(guó)）上。轉(zhuǎn)印完成后的PVDF膜用5%脫脂奶粉（Thermofisher，美國(guó)）封閉2 h。一抗，血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM） （ab33513，Abcam，1∶1 000）；氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）（8284 -1 EPITOMICS 1∶1 000）；β-actin（sc-130657 santa cruz，1∶2 000），IL-6（sc-1266，santa cruz，1∶800），CD40（sc-975，santa cruz，1∶500）孵育4℃過(guò)夜，磷酸鹽吐溫緩沖液 （PBST）沖洗3×15 min，二抗孵育1 h，PBST沖洗3×10 min后顯色觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的血小板黏附對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響 4組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中氯吡格雷組和聯(lián)合組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性均低于對(duì)照組和阿司匹林組，阿司匹林組150 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2血小板黏附對(duì)經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的影響 4組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中聯(lián)合組50、100、150、200 μl血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性分別低于對(duì)照組、阿司匹林組和氯吡格雷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

2.3阿司匹林和氯吡格雷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)免疫印跡法顯示，阿司匹林和氯吡格雷均能抑制由ox-LDL引起的TM表達(dá)的減少（見(jiàn)圖1）。

2.4阿司匹林和氯吡格雷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)受體表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)免疫印跡法顯示，ox-LDL能明顯誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1表達(dá)，阿司匹林能明顯抑制由ox-LDL引起的LOX-1和IL-6的表達(dá)；而氯吡格雷則能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞CD40的表達(dá) （見(jiàn)圖2）。

圖1　阿司匹林和氯吡格雷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的影響Figure 1 Effects of aspirin and clopidogrel on TM expression in endothelial cells

表1　4組經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的不同水平血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的比較?。ā纒）Table 1 Comparison of adhesion activity of platelet treated by different levels of aspirin/clopidogrel to endothelial cell matrix among 4 groups

表1　4組經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的不同水平血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的比較?。ā纒）Table 1 Comparison of adhesion activity of platelet treated by different levels of aspirin/clopidogrel to endothelial cell matrix among 4 groups

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與阿司匹林組比較，△P＜0.05

組別　例數(shù)　50 μl　100 μl　150 μl　200 μl ±0.160阿司匹林組　8　0.413±0.088　0.678±0.032　1.023±0.072*　1.349±0.094氯吡格雷組　8　0.231±0.018*△　0.341±0.084*△　0.335±0.035*△　0.429±0.118*△聯(lián)合組　8　0.298±0.120*△　0.277±0.036*△　0.269±0.091*△　0.318±0.129*△F值對(duì)照組　8　0.490±0.098　0.756±0.110　1.210±0.087　1.463 ＜0.05?。?.05?。?.05　＜0.05 11.462　63.273　163.608　135.523 P值

表2　4組不同水平血小板黏附經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的比較?。ā纒）Table 2 Comparison of adhesion activity of platelet to endothelial cell matrix treated by different levels of aspirin/clopidogrel among 4 groups

表2　4組不同水平血小板黏附經(jīng)阿司匹林和氯吡格雷處理的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)活性的比較?。ā纒）Table 2 Comparison of adhesion activity of platelet to endothelial cell matrix treated by different levels of aspirin/clopidogrel among 4 groups

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與阿司匹林組比較，△P＜0.05；與氯吡格雷組比較，○P＜0.05

組別　例數(shù)　50 μl　100 μl　150 μl　200 μl ±0.161阿司匹林組　8　0.410±0.078　0.478±0.016*　0.723±0.031*　0.892±0.079*氯吡格雷組　8　0.525±0.045　0.641±0.041*△　0.735±0.060*　0.829±0.094*聯(lián)合組　8　0.198±0.012*△○　0.277±0.500*△○　0.369±0.357*△○　0.418±0.106*△○F值對(duì)照組　8　0.490±0.092　0.856±0.097　1.321±0.071　1.556 ＜0.05?。?.05?。?.05?。?.05 20.758　69.763　155.063　67.913 P值

圖2　阿司匹林和氯吡格雷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)受體表達(dá)的影響Figure 2 Effects of aspirin and clopidogrel on expression of endothelial cellmatrix receptor

3　討論

冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后血管被撐開(kāi)并受損，激活凝血過(guò)程，凝血因子復(fù)合物和纖維結(jié)合蛋白從損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中釋放，導(dǎo)致血小板快速聚集，引起血栓形成［7］。此外，受損部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血液后，內(nèi)皮細(xì)胞表面的血栓素受體與血小板產(chǎn)生的血栓素結(jié)合后激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，氧化應(yīng)激相關(guān)的因子也參與到整個(gè)過(guò)程中，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，加速細(xì)胞因子的釋放，啟動(dòng)血管重鑄進(jìn)程［8］。血管損傷后低密度脂蛋白（LDL）轉(zhuǎn)移到血管腔內(nèi)被氧化成ox-LDL，其激活內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡并將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，誘導(dǎo)纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）表達(dá)和血小板活化，促進(jìn)血栓形成［9-10］。

本研究在體外利用血管損傷機(jī)制，采用ox-LDL建立SD原代大鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，通過(guò)該模型研究血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板之間的相互作用。結(jié)果顯示，口服喂養(yǎng)氯吡格雷3 d后SD大鼠PRP對(duì)ox-LDL處理后的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的黏附活性明顯降低；阿司匹林組的血小板黏附活性降低并不明顯，僅150 μl血小板黏附活性低于對(duì)照組。然后，通過(guò)阿司匹林和氯吡格雷處理大鼠內(nèi)皮細(xì)胞24 h后制作內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞板，體外血小板黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何處理的血小板對(duì)阿司匹林和氯吡格雷處理的內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)均表現(xiàn)出黏附活性的降低，且兩種藥物聯(lián)合能明顯降低血小板黏附活性。

為何針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物處理能明顯降低血小板對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的黏附？凝血酶能誘導(dǎo)血栓素合成酶（TXS）催化環(huán)氧合酶產(chǎn)物-前列腺素合成血栓素A2（TXA2）生成，導(dǎo)致血管收縮，血小板活化和聚集，而TM降低能抑制血栓降解，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)［11］。有研究表明，ox-LDL能明顯上調(diào)TXA2，在轉(zhuǎn)錄水平上降低TM表達(dá)，TM與凝血酶結(jié)合后可降低凝血酶的凝血活性［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能明顯下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)，從而增強(qiáng)凝血酶的活性，誘導(dǎo)血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間產(chǎn)生凝集反應(yīng)。而阿司匹林和氯吡格雷能逆轉(zhuǎn)由ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的降低，為降解血栓創(chuàng)造條件。

CD40是免疫反應(yīng)中的重要因子，主要在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞中表達(dá)［2］。CD40與CD40L結(jié)合后啟動(dòng)炎性反應(yīng)，加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Kuzniatsova等［13］研究認(rèn)為，氯吡格雷與阿司匹林的不同之處在于前者抗血小板凝集與抗炎性反應(yīng)無(wú)關(guān)，但本研究發(fā)現(xiàn)氯吡格雷能降低內(nèi)皮細(xì)胞 CD40表達(dá)，表明氯吡格雷抗血小板的凝集可能與炎性反應(yīng)相關(guān)，但氯吡格雷對(duì)炎性因子IL-6的表達(dá)無(wú)明顯影響，證明其抗血小板的凝集并不是通過(guò)白介素通路起作用。具體的機(jī)制還需進(jìn)一步深入了解。

LOX-1是ox-LDL的受體，LOX-1上調(diào)能促進(jìn)炎性反應(yīng)，加速細(xì)胞凋亡和泡沫細(xì)胞形成等［14］。本研究結(jié)果顯示，氯吡格雷對(duì)ox-LDL引起的LOX-1的上調(diào)無(wú)明顯抑制作用；阿司匹林能明顯抑制ox-LDL引起的LOX-1和IL-6的表達(dá)；而兩者聯(lián)合具有的協(xié)同作用能明顯降低由ox-LDL引起的LOX-1和IL-6的表達(dá)。炎性因子表達(dá)的降低反饋調(diào)節(jié)降低血栓素的生成，在體外表現(xiàn)出降低血小板對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附活性［8］。

綜上所述，氯吡格雷和阿司匹林聯(lián)合分別從上調(diào)ox-LDL引起的TM的降低，降低凝血酶活性和抑制ox-LDL引起的CD40和IL-6的表達(dá)，降低炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)降低血小板對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。

［1］Wallace EL，Smyth SS.Targeting platelet thrombin receptor signaling to prevent thrombosis［J］.Pharmaceuticals（Basel），2013，6 （8）：915-928.

［2］Yin T，Miyata T.Pharmacogenomics of clopidogrel：evidence and perspectives［J］.Thromb Res，2011，128（4）：307-316.

［3］Garabedian T，Alam S.High residual platelet reactivity on clopidogrel：its significance and therapeutic challenges overcoming clopidogrel resistance［J］.Cardiovasc Diagn Ther，2013，3（1）：23-37.

［4］Patrono C.Aspirin as an antiplatelet drug［J］.N Engl J Med，1994，330（18）：1287-1294.

［5］RaoGH，F(xiàn)areedJ.Aspirinprophylaxisforthepreventionof thrombosis：expectations and limitations［J］.Thrombosis，2012 （2012）：104707.

［6］Bartorelli AL，Tamburino C，Trabattoni D，et al.Comparison of two antiplatelet regimens（aspirin alone versus aspirin+ticlopidine or clopidogrel）after intracoronary implantation of a carbofilm-coated stent［J］.Am J Cardiol，2007，99（8）：1062-1066.

［7］Inoue T，Croce K，Morooka T，et al.Vascular inflammation and repair：implications for re-endothelialization，restenosis，and stent thrombosis［J］.JACC Cardiovasc Interv，2011，4（10）：1057-1066.

［8］Packard RR，Libby P.Inflammation in atherosclerosis：from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction［J］.Clin Chem，2008，54（1）：24-38.

［9］Kohler HP，Grant PJ.Plasminogen-activator inhibitor type 1 and coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2000，342（24）：1792-1801.

［10］Xu S，Ogura S，Chen J，et al.LOX-1 in atherosclerosis：biological functions and pharmacological modifiers［J］.Cell Mol Life Sci，2013，70（16）：2859-2872.

［11］Nie D，Che M，Zacharek A，et al.Differential expression of thromboxane synthase in prostate carcinoma：role in tumor cell motility［J］.Am J Pathol，2004，164（2）：429-439.

［12］Weisel JW，Nagaswami C，Young TA，et al.The shape of thrombomodulin and interactions with thrombin as determined by electron microscopy［J］.J Biol Chem，1996，271（49）：31485 -31490.

［13］Kuzniatsova N，Balakrishnan B，Lip GY，et al.No effect of clopidogrel activity or cessation on vascular function or markers of inflammation［J］.Int J Angiol，2012，21（4）：195-200.

［14］Wetterau E，Stecher SS，Wolff B，et al.Human endothelial lecitin -like oxLDL receptor-1（LOX-1）expression is not associated with impairment of endothelium-dependent vasoreactivity in conduit vessels［J］.J Physiol Pharmacol，2013，64（4）：465-472.

（本文編輯：賈萌萌）

Effects of Aspirin and Clopidogrel on the Adhesion Activity of Platelet to Endothelial Cell Matrix in Vitro and ItsMechanism

ZHU Jin-kun，MAO Hua，YIN Yang-guang，et al.The First People′s Hospital of Guiyang，Guiyang 550000，China

Objective To study the effects of aspirin and clopidogrel on the adhesion activity of platelet to endothelial cell matrix in vitro and its mechanism，and to find the reasons why combination use of two drugs is better than monotherapy.Methods A total of 42 healthy female SD rats were bought from the animal centre of Third Military Medical University.By using random number table method，SD rats were divided into aspirin group（8 rats），clopidogrel group（8 rats），aspirin and clopidogrel（combination）group（8 rats），control group（8 rats），the other 10 rats were used for primaryisolation and culture of cells.The isolated and cultured primary rat vascular endothelial cells were treated with ox-LDL to establish damaged vascular endothelial cell model.100 mg/kg aspirin，10 mg/kg clopidogrel，combination of 100 mg/kg aspirin and 10 mg/kg clopidogrel，and 200 μl castor oil were used respectively to prepare endothelial cell matrix plate.3 days before the separation and preparation of platelet from plasma，rats in aspirin group were fed with 100 mg·kg-1·d-1aspirin，rats in clopidogrel group were fed with 10 mg·kg-1·d-1clopidogrel，rats in aspirin and clopidogrel group were fed with 100 mg·kg-1·d-1aspirin and 10 mg·kg-1·d-1clopidogrel，rats in control group were fed with castor oil 200 μl per day.ELISA assay was used to evaluate the amount of platelets which adhered to the endothelial matrix.Western blotting technology was used to evaluate the effects of aspirin and clopidogrel on expression of thrombomodulin（TM），lectin like oxidized low density lipoprotein receptor -1（LOX-1）and CD40in vascular endothelial cells.Results The adhesion activity of aspirin/clopidogrel-treated platelet to endothelial cell matrix：there were significant differences in adhesion activity of aspirin/clopidogrel-treated（50，100，150，200 μl）platelet to endothelial cell matrix among 4 groups（P＜0.05），adhesion activity of aspirin/clopidogrel-treated platelet to endothelial cell matrix in clopidogrel group and combination group was significantly lower than that in control group and aspirin group，respectively，adhesion activity of aspirin/clopidogrel-treated（150 μl）platelet to endothelial cell matrix in aspirin group was significantly lower than that in control group（P＜0.05）.The adhesion activity of platelet to aspirin/clopidogreltreated endothelial cell matrix：there were significant differences in adhesion activity of platelet to aspirin/clopidogrel-treated （50，100，150，200 μl）endothelial cell matrix among 4 groups（P＜0.05），adhesion activity of platelet to aspirin/ clopidogrel-treated（50，100，150，200 μl）endothelial cell matrix in combination group was significantly lower than that in control group，aspirin group，clopidogrel group，respectively（P＜0.05）.According to western blotting results，both aspirin and clopidogrel could inhibit ox-LDL-induced decreasing expression of TM.Ox-LDL could induce LOX-1 expression in vascular endothelial cells，aspirin could inhibit ox-LDL-induced expression of LOX-1 and IL-6 obviously，clopidogrel could inhibit CD40expression in endothelial cells obviously.Conclusion Both aspirin and clopidogrel can reduce adhesion activity of platelet to endothelial cell matrix through increasing TM level and inhibiting inflammatory factors.The combination use of the two drugs can inhibit ox-LDL-induced expression of inflammatory cytokines obviously，and reduce the adhension of platelet to endothelial cell matrix.

Clopidogrel；Aspirin；Blood platelets；Endothelial cell matrix

R 973

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.03.011

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（黔科合SY［2010］3087）

550000貴州省貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院（朱晉坤，毛華，董文，杜峰，魯玉明，熊宗華）；第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院（尹揚(yáng)光，鄧夢(mèng)揚(yáng)）

朱晉坤，550000貴州省貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院；E-mail：jkz2001@163.com

2014-02-05；

2014-10-15）