大菱鲆病原鰻弧菌的檢驗與分析

郭楊柳 吳楠 房海 陳翠珍 李艷云 王曉珊 盧會鵬 張東林

大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）是一種名貴的海洋經(jīng)濟(jì)魚類，原產(chǎn)于英國。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的雷霽霖院士于1992年8月首次將其引入我國，并經(jīng)過一系列關(guān)鍵養(yǎng)殖技術(shù)研究取得成功，很快在我國北方沿海地區(qū)形成了大規(guī)模的工廠集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)［1］。近年來，隨著養(yǎng)殖量的迅速增大，尤其是集約化的高密度養(yǎng)殖生產(chǎn)，導(dǎo)致大菱鲆疾病相繼出現(xiàn)，特別是由某種病原微生物引起的感染病（Infectious diseases）時有發(fā)生，并常常會導(dǎo)致較大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。

作者在對養(yǎng)殖魚類感染病的病原研究中，從養(yǎng)殖大菱鲆患病死亡及瀕死魚中經(jīng)常分離到病原細(xì)菌，其中尤以鰻弧菌（Vibrio anguillarum Bergeman 1909）的分離頻率較高，且分離菌株均具有較強(qiáng)的致病作用，能引起不同日齡大菱鲆發(fā)生敗血性感染病。本研究對從自然發(fā)生的大菱鲆鰻弧菌感染病（死）魚苗分離的鰻弧菌菌株，進(jìn)行了比較系統(tǒng)的檢驗與分析，旨為對由鰻弧菌引起的大菱鲆弧菌?。╒ibriosis）的有效預(yù)防與控制。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年5月，河北某水產(chǎn)養(yǎng)殖場的大菱鲆魚苗大量死亡。主要表現(xiàn)為體表彌漫性出血，有的病魚腹部臌脹、腹內(nèi)積液（充盈淡紅色腹水），肝臟蒼白易碎。在5月13日的發(fā)病死亡高峰期，取發(fā)病后剛剛死亡大菱鲆魚苗進(jìn)行病變特征檢驗后，分別以其肝臟組織及腹水為材料，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24-48h；對分離菌做純培養(yǎng)并統(tǒng)一編號后，進(jìn)行檢驗與分析。

1.2 方法

1.2.1 分離菌株的表觀分類學(xué)指征檢驗 對分離保存的純培養(yǎng)菌株，分別進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性等這些表觀分類學(xué)指征的系統(tǒng)檢驗。生理生化特性檢驗，采用法國BioméRieux細(xì)菌自動鑒定儀（ATB1525-expression），并對一些項目內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充試驗［3］。

1.2.2 分離菌株的16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 擇經(jīng)表觀分類學(xué)指征檢驗后的代表菌株，進(jìn)行16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。方法是將供試菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，28℃（110r/min）振蕩培養(yǎng)16h作為供試菌液，采用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，參照相應(yīng)的方法提取細(xì)菌DNA作為PCR模板。

以弧菌檢驗的通用引物，即對應(yīng)于大腸埃希氏菌（Escherichia coli）16S rRNA基因第8-27個堿基位置的 5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3'為正向引物、對應(yīng)于大腸埃希氏菌16S rRNA基因第1492-1510 個堿基位置的5'-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT -3'為反向引物（1492R），按常規(guī)方法對供試菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增［4］；即在50μL反應(yīng)體系中含有 2×PCRmix緩沖液 25μL、引物各 1μL、DNA 模板 4μL、無菌蒸餾水19μL，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性 1min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃溫育6min。所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，提交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因序列測定。

對所測定的基因序列，通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，使用DNASTAR軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫存中獲得的相似性較高的基因序列進(jìn)行多序列匹配排列（Multiple Alignment），采用鄰接法（Neighbor joining method）構(gòu)建分支系統(tǒng)樹。

1.2.3 免疫血清學(xué)檢定 以用已知大菱鲆病原鰻弧菌制備的全菌體抗原，經(jīng)多次免疫家兔制備的相應(yīng)抗血清，分別對供試菌株做玻片凝集反應(yīng)，進(jìn)行血清型的定性實驗，以呈現(xiàn)明顯凝集（++）判定為陽性。同時，分別以大菱鲆病原遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、正常健康家兔血清、無菌生理鹽水，作為陰性實驗對照［4］。

1.2.4 菌株分類位置確定 根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征、理化特性等表觀分類學(xué)指征的檢驗結(jié)果，主要參照第2版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）及有關(guān)資料，并結(jié)合16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、免疫血清學(xué)的測定結(jié)果，對供試菌株進(jìn)行分類學(xué)的歸類判定［3，5］。

1.2.5 人工感染實驗 擇經(jīng)分類鑒定后的代表菌株，以其純培養(yǎng)物分別移接普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)28℃培養(yǎng)18h作為供試菌液。分別對體重200-250 g/尾的健康大菱鲆，進(jìn)行腹腔注射接種的感染實驗（0.1mL/尾），以被感染發(fā)病、死亡，呈現(xiàn)出同自然病（死）大菱鲆的發(fā)病和病變特征、并能從病變組織中重新分離回收到原感染菌，作為致病作用的判定指標(biāo)；同時設(shè)立僅接種無菌普通營養(yǎng)肉湯的實驗對照，須在實驗觀察期內(nèi)健康存活。供試大菱鲆在實驗前統(tǒng)一養(yǎng)殖于水溫19-21℃的實驗水族箱中，養(yǎng)殖觀察7 d且健康才可用于實驗。

2 結(jié)果

2.1 菌株與編號

取發(fā)病后剛剛死亡大菱鲆魚苗10尾進(jìn)行細(xì)菌分離，從其肝臟組織及腹水中，均分離到了多量且純一的同種細(xì)菌。從每尾大菱鲆魚苗的分離菌，各取1個菌落移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24h作為純培養(yǎng)菌，于4℃普通冰箱保藏供實驗用。菌株編號系按分離地與日期，依次為HC120513-1至 HC120513-10。

2.2 形態(tài)與培養(yǎng)特征

2.2.1 形態(tài)特征 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24h后做涂片標(biāo)本進(jìn)行革蘭氏染色檢查，均為革蘭氏染色陰性、桿狀及短桿狀（多數(shù)菌體稍彎曲）、一端或兩端鈍圓（有的一端或兩端稍尖）、散在（個別成雙）、無芽孢、大小多在0.3-0.7 μm×1.0-2.2 μm。進(jìn)行負(fù)染色的透射電子顯微鏡標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，菌體彎曲、表面光滑，但不平整、有微泡（Micorovesicale）、端生單鞭毛（圖1）。常表現(xiàn)輕微下陷（菌落長入培養(yǎng)基中），刮下菌落后可見長入培養(yǎng)基中留下的菌落痕跡（圖4）。

圖2 鰻弧菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

圖1 鰻弧菌透射電子顯微鏡照片（×4 000）

2.2.2 生長情況與菌落特征 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂、硫代硫酸鈉檸檬酸鈉膽酸鈉蔗糖瓊脂（Thiosulfate citrate bile salt sucrose agar，TCBS）培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)后檢查生長情況及菌落特征。結(jié)果在普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，與用此兩種培養(yǎng)基從病死大菱鲆魚苗所分離的一致，表現(xiàn)為在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h檢查菌落呈圓型光滑、邊緣整齊、較隆起、淺橘黃色、不透明、直徑多在0.8-1.0 mm（培養(yǎng)48h的多在1.5-1.8 mm），生長較豐盛（圖2）；在血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生長情況與菌落特征基本同在普通營養(yǎng)瓊脂上的，培養(yǎng)24h的菌落直徑多在1.0-1.2 mm（培養(yǎng)48h的多在 1.5-2.0 mm），β-溶血（圖 3）；在 TCBS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h檢查不見明顯生長或僅形成直徑多在0.3 mm左右的小菌落（培養(yǎng)48h的可達(dá)1.2-1.5 mm），菌落圓形光滑、邊緣整齊、較隆起、黃色，常表現(xiàn)是僅在做劃線接種的起始部長出菌苔及少數(shù)菌落，菌落（苔）黏稠不易乳化，菌落周圍培養(yǎng)基

圖3 鰻弧菌在血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

2.2.3 適宜生長的溫度 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24-48h檢查，表現(xiàn)在37℃培養(yǎng)呈微弱生長，但比在28℃培養(yǎng)的表現(xiàn)生長緩慢。

2.3 理化特性

供試10株純培養(yǎng)菌，對所測項目的結(jié)果表現(xiàn)一致。均可還原硝酸鹽，對O/129敏感，剩余項目如表1所示。

2.4 16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育

擇經(jīng)表觀分類學(xué)指征檢驗后的HC120513-1作為代表菌株，進(jìn)行的16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果得到了長度為1450bp的基因序列。將此菌株的16S rRNA序列在NCBI上進(jìn)行同源性檢索發(fā)現(xiàn)，其與弧菌屬（Vibrio Pacini 1854）細(xì)菌的16S rRNA基因序列自然聚類；在檢索出的弧菌屬細(xì)菌序列中，此菌株與它們的同源性都在99％。選取20株弧菌屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，此菌株與編號為KC884632的鰻弧菌聚為一個分支（圖2）。

表1 供試菌株的理化特征

2.5 血清學(xué)凝集實驗

以10株純培養(yǎng)菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、28℃培養(yǎng)24h的培養(yǎng)物為全菌體抗原，進(jìn)行的血清學(xué)凝集反應(yīng)實驗，結(jié)果均與供試鰻弧菌全菌體抗血清呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)（++++），與正常健康家兔血清、無菌生理鹽水均為陰性。對照用的遲鈍愛德華氏菌，與供試鰻弧菌全菌體抗血清、正常健康家兔血清、無菌生理鹽水均為陰性（圖5）。

2.6 菌種判定

根據(jù)對10株供試菌表觀分類學(xué)指征的檢驗、16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析、免疫血清學(xué)凝集反應(yīng)檢定結(jié)果，綜合分析判定為弧菌屬的鰻弧菌。參考菌株：HC120513-1。

2.7 致病作用

將16尾供試大菱鲆，分為每組8尾的兩組隔離養(yǎng)殖于兩個實驗用水族箱中；其中的1組接種供試菌株HC120513-1的菌液為感染實驗組，另外1組接種普通營養(yǎng)肉湯為實驗對照組，分別養(yǎng)殖觀察。結(jié)果如表2所示，實驗組的8尾于接種感染后48h內(nèi)均表現(xiàn)發(fā)病且死亡6尾（死亡率75.0％）；對照組8尾，養(yǎng)殖觀察7 d仍正常存活。

圖4 鰻弧菌在TCBS培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

圖5 實驗菌株與對照菌株的玻片凝集實驗

死亡6尾大菱鲆，均呈現(xiàn)出了同自然發(fā)病的出血、腹水等病變。取其肝臟組織及腹水為材料，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)48h，均分離到了大量純一的同種細(xì)菌；經(jīng)做純培養(yǎng)后進(jìn)行的主要理化特性檢驗，表明為原感染用的鰻弧菌。

3 討論

從發(fā)生大量死亡的養(yǎng)殖大菱鲆魚苗中分離的10株細(xì)菌，通過普通細(xì)菌學(xué)方法檢測為革蘭氏陰性菌，桿狀及短桿狀（多數(shù)菌體稍彎曲），端生單鞭毛，氧化酶反應(yīng)呈陽性，能夠還原硝酸鹽，對弧菌抑制劑O/129敏感等，這些都符合弧菌屬的典型特征。這10株細(xì)菌還能夠利用檸檬酸鹽、丙二酸鹽和酒石酸鹽；分解阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖和甘油產(chǎn)酸，不分解阿東醇、甜醇、赤蘚糖醇、肌醇、乳糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、水楊苷和木糖；過氧化氫酶、吲哚產(chǎn)生、V-P反應(yīng)、明膠酶、DNA酶、β-半乳糖苷酶和精氨酸雙水解酶陽性；H2S產(chǎn)生、賴氨酸及鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶、甲基紅試驗陰性；這是一些主要具有鑒別意義的項目，能夠在弧菌屬中有效區(qū)分鰻弧菌。由此，從生理生化鑒定看，實驗菌株接近于鰻弧菌。

表2 供試菌株對大菱鲆的回歸感染實驗結(jié)果

圖6 鰻弧菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

后續(xù)對10株細(xì)菌進(jìn)行了DNA的提取，擴(kuò)增了通用片段16S rRNA，并建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明菌株與鰻弧菌KC884632聚為一支，相似度最高達(dá)到99.9％，而與霍亂弧菌X74696遺傳距離較遠(yuǎn)一些，相似度只能達(dá)到93.9％，偏低。所以，從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和序列相似度上來看，實驗用菌株與鰻弧菌較近一些。

隨后分別又對回歸感染試驗分離出的細(xì)菌和原分離于病死成年大菱鲆病原鰻弧菌為抗原制備抗血清，能夠發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)，這不僅對鰻弧菌的檢驗具有重要意義［6］，也初步顯示了在這些不同來源菌株間的血清型同源性；人工感染大菱鲆的實驗結(jié)果，顯示具有強(qiáng)致病作用。進(jìn)一步說明盡管鰻弧菌雖屬于水環(huán)境微生物區(qū)系正常菌群的一種弧菌，但更是海水養(yǎng)殖魚類的一種常見的重要病原菌。據(jù)此，可考慮將此菌列為養(yǎng)殖用海水清潔度及弧菌病暴發(fā)的監(jiān)測菌。

已有的研究報告顯示，在水溫以及鹽度和有機(jī)物含量較高的養(yǎng)殖環(huán)境，鰻弧菌的數(shù)量急劇增加；養(yǎng)殖密度的增大、養(yǎng)殖水體中溶氧量的降低、養(yǎng)殖水溫的驟變等因素，可使魚類處于應(yīng)激狀態(tài)并導(dǎo)致免疫機(jī)能下降，更容易引起鰻弧菌的感染［7］。顯然，在諸多養(yǎng)殖技術(shù)難以規(guī)范的實際情況下，應(yīng)用鰻弧菌疫苗進(jìn)行免疫接種的方法，可能會構(gòu)成最為有效的途徑之一；但要做到這一點，對病原鰻弧菌的廣泛分離與檢驗是一個重要方面的內(nèi)容，其中尤以血清學(xué)檢驗確定血清型別是最為需要的。但作為免疫原性來講，還需要明確在抗原表達(dá)、免疫保護(hù)效果方面的應(yīng)用價值。對這些方面的內(nèi)容，我們還在進(jìn)一步的研究中；也期望能為魚類免疫預(yù)防的實踐應(yīng)用，提供具有可行性的基礎(chǔ)資料。

4 結(jié)論

本次報告分離于大菱鲆魚苗的10株病原細(xì)菌，經(jīng)過一系列形態(tài)特征和菌落特征觀察、生理生化鑒定、16S r RNA系統(tǒng)學(xué)發(fā)育分析鑒定是鰻弧菌，并對大菱鲆進(jìn)行了回歸感染試驗，最終可得出這10株病原菌確實是導(dǎo)致大菱鲆致病的鰻弧菌。

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