Cry1Ie蛋白的模擬胃腸液消化穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性分析

李欣竹 耿麗麗 高繼國(guó) 張杰

cry1Ie基因是由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)并克隆的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的模式基因［8］，其編碼蛋白只有81kD［9］，不同于大多數(shù)Cryl類(lèi)蛋白的130kD。該基因的另一個(gè)特點(diǎn)是在Bt菌株中多數(shù)是沉默的，而在大腸桿菌中卻能過(guò)表達(dá)［10］。Cry1Ie蛋白對(duì)小菜蛾（Plutella xylostella）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）及大豆食心蟲(chóng)（Leguminivora glycinivorella）均有很強(qiáng)殺蟲(chóng)活性［11］，并且該蛋白與商業(yè)化種植Bt作物中的Cry1Ab和Cry1Ac蛋白無(wú)交互抗性，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值［12］。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所合作，將cry1Ie基因應(yīng)用于抗蟲(chóng)玉米的培育［13，14］，目前已經(jīng)進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn)階段。除了對(duì)亞洲玉米螟有顯著的防治效果，對(duì)Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)品系也具有殺蟲(chóng)活性［15］。

針對(duì)具有巨大應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)化前景的Cry1Ie蛋白，本研究在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中將其進(jìn)行表達(dá)、提取和純化。對(duì)Cry1Ie蛋白進(jìn)行熱穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，并且分析處理后該蛋白對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 克隆載體、細(xì)菌表達(dá)載體pET-21 b，感受態(tài)細(xì)胞DH5α、Rossetta菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 各種抗生素均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；常規(guī)化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。酪蛋白（α-casein）、大豆胰蛋白酶抑制劑（Soybean trypsin inhibitor，STI）、胃蛋白酶（Pepsin）、胰蛋白酶（Trypsin），均購(gòu)自Solarbio公司；亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、人工飼料由中國(guó)農(nóng)業(yè)學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米害蟲(chóng)組提供。

1.1.3 模擬胃消化液（Simulated gastric fluid，SGF）本標(biāo)準(zhǔn)中采用的胃蛋白酶（Pepsin）活力≥3 000U/mg。

根據(jù)公式（1）計(jì)算100mL模擬胃液中的胃蛋白酶的添加量：

式中，A：胃蛋白酶添加量，單位為毫克（mg）；B：胃蛋白酶活力，單位為單位活力每毫克（U/mg）。

“要做到客戶去找你，而不是你去找客戶，這樣才能使企業(yè)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展?！毕乃閵玫囊幌捊o我們留下了深刻印象。

稱(chēng)取0.2 g氯化鈉（NaCl）和Amg胃蛋白酶，加入70mL重蒸餾水，加入730μL鹽酸，再用鹽酸調(diào)pH至1.2，加水定容至100mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.4 模擬腸消化液（Simulated gastric fluid，SIF）

稱(chēng)取0.7 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于25mL重蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，加入19mL 0.2mol/L氫氧化鈉溶液和40mL重蒸餾水，加入1.0 g胰蛋白酶，用0.2mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5，加重蒸餾水定容至100mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品蛋白溶液（2g/L）：稱(chēng)取2mg樣品蛋白，定容于1mL重蒸餾水中，混勻。

1.1.5 玉米粉提取液 將非轉(zhuǎn)基因玉米粉在液氮中磨成細(xì)粉，稱(chēng)取0.1g，加入1mL重蒸水，混勻后13 500×g、4℃離心5min，取上清。

1.2 方法

1.2.1 蛋白表達(dá)與表達(dá)條件的優(yōu)化 挑取陽(yáng)性克隆接種于含有氨芐青霉素和氯霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min培養(yǎng)6h，以1％的比例接種于300mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.5左右時(shí)，加入0.1mmol/L IPTG，在18℃、150r/min條件下誘導(dǎo)12h。8000r/min離心10min收集菌體。將菌體再次懸浮于30mL的緩沖液20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，利用超聲波破碎菌體（寧波新芝SCIENTZ II-D），功率45％，工作3s，暫停5s，共超聲破碎5min。10000r/min 離心20min，分別收集上清和沉淀，然后通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白。在此基礎(chǔ)上，挑取部分陽(yáng)性菌株，通過(guò)改變IPTG的濃度（0.1、0.5、1和1.0mmol/L）以及誘導(dǎo)表達(dá)的溫度（18和30℃），尋找最佳的目標(biāo)蛋白表達(dá)條件。

1.2.2 目的蛋白的純化 準(zhǔn)備5mL的鎳柱，首先用無(wú)菌水清洗Ni-NTA柱（5倍柱體積），然后用上樣緩沖液I（50mmol/L Na2CO3，pH 10.5，含50mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl）進(jìn)行平衡（5倍柱體積）。加入10mL的蛋白，反復(fù)上樣4次。用上樣緩沖液I洗脫未結(jié)合的蛋白（5倍柱體積）。用同樣體積的含有250mmol/L咪唑的緩沖液（50mmol/L Na2CO3，pH10.5，含有0.5mol/L NaCl）洗脫目的蛋白。用500mmol/L咪唑的緩沖液（50mmol/L Na2CO3，pH 10.5，含有0.5mol/L NaCl）清洗殘余的蛋白，SDSPAGE檢測(cè)純化效果。

1.2.3 模擬胃液穩(wěn)定性測(cè)定 向無(wú)菌1.5mL離心管中加入18μL模擬胃消化液，37℃恒溫水浴5min。分別加入2μL樣品蛋白（5mg/mL）、模擬胃液空白對(duì)照、不穩(wěn)定對(duì)照蛋白（5mg/mL酪蛋白）、穩(wěn)定對(duì)照蛋白（5mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑），迅速漩渦振蕩并快速置于37℃水浴，在每個(gè)反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，迅速加入10μL 1.5mol/L 碳酸鈉溶液，冰浴，加入7.5μL 5×SDS-PAGE蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴加熱5min，取出后13 500×g離心5min，冷卻至室溫進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。蛋白反應(yīng)時(shí)間依次為0和15s，1、2、5、10、30 和 60min。不穩(wěn)定對(duì)照酪蛋白反應(yīng)時(shí)間為2min，穩(wěn)定對(duì)照STI 反應(yīng)時(shí)間為1h。胃蛋白酶對(duì)照組為不含胃蛋白酶的模擬胃液，其他步驟同上。

1.2.4 模擬腸液穩(wěn)定性測(cè)定 在已滅菌的1.5mL離心管中加入 18μL模擬腸消化液（SIF）溶液，37℃恒溫水浴5min。分別加入2μL樣品蛋白（2mg/mL）、模擬腸液空白對(duì)照、不穩(wěn)定對(duì)照蛋白（2mg/mL酪蛋白）、穩(wěn)定對(duì)照蛋白（2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑），漩渦振蕩后快速置于37℃水浴中，在每個(gè)反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)立即加入5μL 5×SDS-PAGE蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴加熱5min，取出后13 500×g離心5min，冷卻至室溫進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)依次為0和15s、1、2、5、10、30和60min。不穩(wěn)定對(duì)照酪蛋白反應(yīng)時(shí)間為2min，穩(wěn)定對(duì)照STI 反應(yīng)時(shí)間為1h。胰蛋白酶對(duì)照組為不含胰蛋白酶的模擬腸液，其他步驟同上。

1.2.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定 將目的蛋白干粉分別用超純水和玉米粉提取液中溶解后在沸水浴中加熱，在反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出 20μL，立即加入 5μL 5×SDS-PAGE蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴加熱5min，取出后13 500×g離心5min，冷卻至室溫進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。反應(yīng)時(shí)間依次為 15s、1、2、5、10、30和60min。

1.2.6 亞洲玉米螟生物活性測(cè)定 亞洲玉米螟選用初孵幼蟲(chóng)，稱(chēng)取30g人工飼料置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入3 000μL待測(cè)樣品溶液，用藥匙充分?jǐn)嚢杈鶆颍覝胤胖?，使飼料多余水分蒸發(fā)。將全部飼料分裝于3個(gè)一次性培養(yǎng)皿中（直徑=5cm）。用毛筆輕輕接入幼蟲(chóng)，每培養(yǎng)皿接30頭蟲(chóng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，接蟲(chóng)后以2層衛(wèi)生紙嚴(yán)格密封，防止幼蟲(chóng)逃逸。放置25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱中溫度與濕度，濕度＜30％時(shí)，及時(shí)添加蒸餾水以保持濕度。每天觀察，檢查光照、濕度、溫度以及飼料是否霉變，是否有水蒸氣凝結(jié)。7d分別調(diào)查死、活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率、校正死亡率。實(shí)驗(yàn)樣品分別為模擬胃液37℃消化15s、模擬腸液37℃消化1h、超純水中100℃放置1h、玉米葉片提取液中100℃放置30min。對(duì)照組分別為Cry1Ie原蛋白陽(yáng)性對(duì)照2μg/g和5μg/g、模擬胃液對(duì)照、模擬腸液對(duì)照、超純水對(duì)照、玉米粉提取液對(duì)照。

1.2.7 SDS-PAGE分析 取蛋白樣品進(jìn)行制樣，100℃煮沸10min，13 000×g離心10min，取上清點(diǎn)樣，4％濃縮膠，10％分離膠，80 V電泳20min，150 V電泳直到膠底邊緣。電泳結(jié)束后取出凝膠，進(jìn)行脫色、染色及掃描圖譜，參見(jiàn)薩姆布魯克等［16］的方法。

2 結(jié)果

2.1 Cry1Ie蛋白提取及表達(dá)條件的確定

通過(guò)在不同溫度條件和不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在30℃時(shí)誘導(dǎo)Cry1Ie蛋白表達(dá)量明顯低于18℃，在18℃時(shí)0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，Cry1Ie重組蛋白的表達(dá)量最高（圖1-A，泳道1）。最終選擇18℃、0.1mmol/L IPTG、150r/min誘導(dǎo)12h作為該蛋白提取的最優(yōu)條件。

圖1 不同溫度和IPTG濃度下可溶性（A）和包涵體（B）Cry1Ie蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

2.2 Cry1Ie蛋白純化

首先對(duì)可溶性Cry1Ie蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和純化，在250mmol/L咪唑濃度下洗脫出濃度較高的純蛋白（圖2-A）。再將250mmol/L咪唑洗脫下來(lái)的蛋白用Millipore進(jìn)行濃縮后進(jìn)行分子篩層析，在出現(xiàn)洗脫峰時(shí)收集流穿，獲得了純蛋白（圖2-B），通過(guò)Image J軟件分析蛋白純度達(dá)到91％。

2.3 Cry1Ie蛋白在模擬胃液中的穩(wěn)定性

Cry1Ie蛋白在模擬胃液中不穩(wěn)定，在15 s內(nèi)可被消化完全，SDS-PAGE檢測(cè)不到小片段殘留（圖3-A）。不穩(wěn)定對(duì)照酪蛋白在模擬胃液中2min后被降解（圖3-B，泳道1），而穩(wěn)定對(duì)照STI在1h內(nèi)沒(méi)有被完全降解（圖3-B，泳道2），說(shuō)明了該消化體系的穩(wěn)定性及有效性。

圖2 Cry1Ie蛋白的Ni-NTA親和層析純化（A）及Superdex-75分子篩層析純化（B）

2.4 Cry1Ie蛋白在模擬腸液中的穩(wěn)定性

Cry1Ie蛋白在模擬腸液中不穩(wěn)定，在15 s內(nèi)可被消化，只有少量的抗蛋白酶核心片段蛋白沒(méi)有被消化（圖4）。不穩(wěn)定對(duì)照酪蛋白在模擬腸液中2min后被降解（圖4，泳道9），穩(wěn)定對(duì)照STI在1h內(nèi)沒(méi)有被降解（圖4，泳道12），說(shuō)明了該消化體系的穩(wěn)定性及有效性（圖4，泳道9-13）。

2.5 Cry1Ie蛋白熱穩(wěn)定性

Cry1Ie蛋白在沸水浴中加熱1h后未降解（圖5-A，泳道2-6），證明純蛋白具有熱穩(wěn)定性。為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中Cry1Ie蛋白的熱穩(wěn)定性，將過(guò)量Cry1-Ie蛋白加入玉米粉提取液中，沸水浴中30min，SDSPAGE檢測(cè)蛋白被完全降解（圖5-B，泳道7-12）。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)處理后的Cry1Ie蛋白對(duì)亞洲玉米螟的生物活性

本實(shí)驗(yàn)中Cry1Ie蛋白濃度為5μg/mL時(shí)，校正死亡率為74％，這與Song等［11］的Cry1Ie對(duì)亞洲玉米螟的生物活性測(cè)定結(jié)果是一致的。模擬胃腸液處理后的Cry1Ie蛋白已經(jīng)失去殺蟲(chóng)活性，100℃超純水處理1h后的蛋白沒(méi)有降解，但是已經(jīng)失去殺蟲(chóng)活性。而在玉米粉提取液中處理30min后的蛋白完全降解，并且失去殺蟲(chóng)活性（表1）。

圖3 Cry1Ie蛋白（A）及對(duì)照蛋白（B）在模擬胃液中的消化穩(wěn)定性分析

圖4 Cry1Ie蛋白在模擬腸消化液穩(wěn)定性

3 討論

本研究獲得了純度為91％的純Cry1Ie蛋白，證明了體外模擬胃腸液消化后及玉米粉提取液中熱處理后Cry1Ie蛋白不穩(wěn)定，并失去對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性。

圖5 Cry1Ie純蛋白（A）在超純水及在玉米粉提取液中（B）的熱穩(wěn)定性分析

自從1987年以來(lái)，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)農(nóng)作物在全世界廣泛種植［1］。對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)尤為重要。目前用于飼料和食品的轉(zhuǎn)基因Bt 作物主要是玉米。在中國(guó)和其他國(guó)家獲得審批的轉(zhuǎn)基因Bt 植物表達(dá)的Cry 蛋白包括Cry1Ab、Cry1F、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry2Ab2、Cry3Bb、Cry34Ab1 和Cry35Ab1等［13］。歐洲食品安全局（EFSA）對(duì)玉米植株中所表達(dá)的Cry 蛋白的食品安全進(jìn)行了評(píng)估，如 Cry1Ab 和 Cry3Bb1［17］、Cry1F［18］、Cry34-Ab1 和 Cry35Ab1［19］和包含一種以上 Cry 蛋白的玉米雜交品種［20，21］。每一個(gè)注冊(cè)的轉(zhuǎn)基因Bt 作物都要根據(jù)國(guó)際食品法典的建議進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，其中包括蛋白質(zhì)特性、在模擬消化液中進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估、在小鼠中進(jìn)行急性高劑量口服毒性試驗(yàn)、與已知毒素和致敏原進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及對(duì)非靶標(biāo)生物的作用。對(duì)具有商業(yè)化前景的Bt作物及其外源蛋白進(jìn)行評(píng)估，為其環(huán)境安全性及食用安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，體外模擬胃腸液消化穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)恰恰是這方面最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的一個(gè)步驟。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)處理后的Cry1Ie蛋白對(duì)亞洲玉米螟室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

本研究選擇具有應(yīng)用前景的Cry1Ie蛋白，并獲得了大量可溶性蛋白，純度達(dá)到91％這與此前的Song等［10］所做的表達(dá)相比，增加了蛋白的可溶性。根據(jù)Guo等［22］所做的IE648蛋白的表達(dá)純化相比，僅僅用Ni-NTA親和層析和分子篩層析就獲得了純度高的Cry1Ie蛋白，大大提高了純化效率。

在2009年，Xu等［7］對(duì)Cry1Ab/Ac融合蛋白進(jìn)行了消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)Cry1Ab/Ac蛋白在模擬消化液中不穩(wěn)定，與本研究的結(jié)果一致。但是在熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，Xu只將目的蛋白溶解于20mmol/L Tris-HCl中進(jìn)行了熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，而本研究同時(shí)將 Cry1Ie蛋白溶解于玉米粉提取液中進(jìn)行熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，證明了其在玉米粉提取液中的熱不穩(wěn)定性。這一實(shí)驗(yàn)?zāi)M了該蛋白作為膳食來(lái)源經(jīng)過(guò)一系列加工后進(jìn)入人體的可能途徑。在對(duì)Cry1Ie蛋白進(jìn)行消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)后，該蛋白都會(huì)以小肽或氨基酸的形式存在，而這些物質(zhì)在人體內(nèi)僅能夠作為膳食來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。除了花粉蛋白，其他所有免疫原性蛋白對(duì)消化酶都有極高的穩(wěn)定性，因此蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以被認(rèn)為是預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)免疫原性的重要參考數(shù)據(jù)［23］。蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化后形成小于3.5kD的小肽和氨基酸，則被認(rèn)為幾乎不可能具有免疫原性［24］。根據(jù)以上研究進(jìn)展，可以初步判斷，Cry1Ie蛋白不具有免疫原性。但是這只是一個(gè)初步的判斷，并不能完全證明其無(wú)免疫原性。因?yàn)槟壳斑€沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗蛋白酶消化與免疫原活性有直接的關(guān)系［24］。

4 結(jié)論

通過(guò)Ni-NTA親和層析系統(tǒng)和分子篩層析系統(tǒng)獲得了Cry1Ie的純蛋白，純度達(dá)到91％對(duì)亞洲玉米螟具有較高的殺蟲(chóng)活性。通過(guò)模擬消化實(shí)驗(yàn)，證明Cry1Ie蛋白在體外模擬胃腸液中不穩(wěn)定，15 s即被降解，對(duì)亞洲玉米螟失去殺蟲(chóng)活性。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明，Cry1Ie蛋白在沸水浴中加熱1h后沒(méi)有降解，并且保持對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性。但是該蛋白在玉米粉提取液中不穩(wěn)定，在沸水浴中30min即被降解，對(duì)亞洲玉米螟失去殺蟲(chóng)活性。

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［20］EFSA. Scientific Opinion on application（reference EFSAGMONL-2005-15）for the placing on the market of the insect-resistant and herbicide-tolerant genetically modified maize 1507×59122,for food and feed uses, import and processing under Regulation（EC）No 1829/2003 from Mycogen Seeds, c /o Dow AgroSciences LLC and Pioneer Hi-Bred International, Inc. as represented by Pioneer Overseas Corporation［Z］. The EFSA Journal, 2009, 1074：1-28.

［21］EFSA. Scientific Opinion on application（EFSA-GMO-NL-2007-39）for the placing on the market of insect resistant and herbicide tolerant genetically modified maize MON89034×MON88017 for food and feed uses import and processing under Regulation（EC）No 1829/2003 from Monsanto. EFSA Panelon Genetically Modified Organisms（GMO）［Z］. The EFSA Journal, 2010, 8：1564.

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