基于全基因組的微生物親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)研究工具——CVTree3

左光宏 郝柏林

分類是人類認(rèn)識自然、探索事物本質(zhì)及其規(guī)律的基本出發(fā)點之一。對生命形式最早的分類系統(tǒng)能上朔到古希臘哲學(xué)家亞里士多德（Aristotle）。對于物種間親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)的研究，不僅加深人們對于自然界的認(rèn)識，還能為一些與人類生命健康有關(guān)的應(yīng)用科學(xué)，如醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與環(huán)境元基因組學(xué)等帶來重要的信息，從而改善人類的生產(chǎn)、生活。傳統(tǒng)的物種分類與親緣關(guān)系的研究，無論是林奈（Carolus Linnaeus）的分類系統(tǒng)，還是達(dá)爾文（Charles Robert Darwin）在《物種起源》中初次設(shè)想的來自共同祖先的親緣關(guān)系，都是根據(jù)生物的形態(tài)特征。這在動、植物等宏觀生物的分類中取得了比較合理的結(jié)果。然而占地球上生命物質(zhì)一半以上的原核生物［1］，卻很難使用這些傳統(tǒng)的方法來實現(xiàn)分類。這是因為當(dāng)尺度下降到微米級，不但生物形態(tài)難以刻畫，并且相同的形態(tài)可能來自完全不同的物種。1985年Carl Woese和同事們分析當(dāng)時僅有的約400條16S rRNA序列，提出了基于系統(tǒng)發(fā)生的主要細(xì)菌門類描述［2］。時至今日，基于16S rRNA序列分析的構(gòu)樹方法現(xiàn)在已經(jīng)被大多數(shù)生物學(xué)家接受。盡管16S rRNA序列分析取得了很大成功，但是它在種以下的層次缺乏分辨能力［3，4］。而環(huán)境元基因組學(xué)、醫(yī)藥微生物學(xué)等應(yīng)用，區(qū)分亞種（Subspecies）、生態(tài)型（Ecotypes）、血清型（Serotypes）、生物變種（Biovars）等菌株種以下的分類需求卻與日俱增。

全基因組包含了生物全部的遺傳信息，其內(nèi)涵遠(yuǎn)遠(yuǎn)豐富于16S rRNA序列，所以分析全基因組數(shù)據(jù)能夠更加準(zhǔn)確與細(xì)致地研究物種的演化與分類。要提高分辨能力，就需要更好地利用全基因組的信息［5］。而且，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，可供研究的全基因組數(shù)據(jù)越來越多。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)顯示，截至2015年10月，已完成測序的基因組項目有7 435個，而正在進(jìn)行的測序計劃則多達(dá)32 976個，而且這些數(shù)字還在快速增加。另外，針對某些特定問題，還有更為龐大的測序計劃。例如，2012年8月，美國食品與藥物管理局、加州大學(xué)戴維斯分校以及安捷倫科技公司發(fā)起了旨在對10萬種食源性致病菌全基因組的測序計劃。針對物種演化研究與分類學(xué)的全基因組測序計劃，2007年5月，美國能源部聯(lián)合基因組中心JGI推出“細(xì)菌和古細(xì)菌基因組百科全書（GEBA）”計劃［6］；2009年8月，我國深圳華大基因研究院倡導(dǎo)了“萬種微生物基因計劃”。這些海量的全基因組數(shù)據(jù)，為基于基因組的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)與分類學(xué)的研究提供了豐富的素材。

素材的積累為研究奠定了基礎(chǔ)，同時也對研究方法提出了更高的要求。迄今對生物演化與分類的研究，主要基于對單個或少數(shù)“同源基因”的序列聯(lián)配（Sequence alignment）。隨著基因組數(shù)目增加，這些方法變得不太適用。首先是基因組多樣性。就已測序的原核生物基因組而言，即使除去一些高度退化的細(xì)菌內(nèi)共生菌，小的基因組不到50萬核苷酸和500個基因［7］，而較大的細(xì)菌基因組則超過1300萬核苷酸和9 380個基因［8］。這使得挑選“同源基因”變得困難。物種數(shù)的增多又使得序列聯(lián)配遇到計算瓶頸；而且，挑選“同源基因”的做法也不能最大限度地利用基因組信息。因此急需發(fā)展不僅不依靠序列聯(lián)配，同時還能最大限度地利用全基因組信息的研究方法。

我們研究組于2003年提出了基于全基因組的親緣關(guān)系與分類研究方法——組分矢量構(gòu)樹法（Composition vector tree，簡稱 CVTree）［9］。它不需要挑選同源基因，不進(jìn)行序列比對，從根本上避開了人為干預(yù)對結(jié)果可能造成的影響。除某些極端情況外，分類結(jié)果幾乎不受基因組大小的影響，從而非常適合用來構(gòu)造跨門、跨界，甚至跨超界的生命之樹的構(gòu)建。目前CVTree方法已經(jīng)成功應(yīng)用到許多物種的分類研究之中，包括病毒［10］、原核生物［11-15］、真菌［16］、葉綠體序列［17］及人類的腸道元基因組［18］。研究表明，CVTree具有比傳統(tǒng)方法更高的分辨力，這使得CVTree方法有望解決過去難以區(qū)分的屬內(nèi)、種內(nèi)的親緣關(guān)系問題。為了方便用戶使用CVTree方法，我們同時開發(fā)了網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器［19，20］。為了適應(yīng)當(dāng)前基因組數(shù)據(jù)的海量增加，又開發(fā)新版的CVTree網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器——CVTree3［21］。除了性能的提高之外，CVTree3服務(wù)器還將由CVTree方法生成的親緣關(guān)系樹與物種的分類系統(tǒng)自動進(jìn)行比較，并在網(wǎng)頁上以可交互作用的形式顯示，為進(jìn)一步研究原核生物的親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)提供方便。本文將簡要介紹CVTree核心算法與CVTree3的使用流程，并利用三個典型實例來介紹CVTree3的可能應(yīng)用。

1 組分矢量方法

1.1 算法——組分矢量構(gòu)樹法

組分矢量構(gòu)樹法（CVTree）是一種基于全基因組研究物種親緣關(guān)系的方法。它首先統(tǒng)計基因組中特定長度短串組，為每個物種構(gòu)造一個高維代表矢量；然后用矢量之間的夾角余弦計算物種間的遺傳距離 ；最后使用鄰接法（Neighbor-joining）［22，23］進(jìn)行構(gòu)樹。它不需要挑選同源基因，不進(jìn)行序列聯(lián)配，從根本上避開了人為干預(yù)對結(jié)果可能造成的影響。實踐表明，基于蛋白質(zhì)序列的組分矢量方法與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)能更好的吻合，下面就以蛋白質(zhì)序列為例來簡要說明CVTree算法。

假設(shè)我們需要對一個給定物種，構(gòu)造基于長度的組分矢量。首先對該基因組的各個基因以長度為窗口，每次滑動一個殘基的方式從前向后移動，并求出各種串的出現(xiàn)頻度即次數(shù)，記為f（a1a2…aK）。則該串的出現(xiàn)概率是：

式中，NK為K串的總數(shù)目。將其用條件概率表達(dá)，

則可得：

此時做一個Markov假定，假設(shè)中K串的出現(xiàn)概率p（a1a2…aK）不依賴于第一個字母a1，則：

而對于條件概率p（aK|a2a3…aK-1），我們可以通過統(tǒng)計更短的串獲得，即：

由此，我們可以根據(jù)K-1串和K-2串來推測出K串概率：

式中，p0表示這個K串概率是由K-1串和K-2串的出現(xiàn)概率給出的估計。把直接統(tǒng)計的K串頻度f與估計值f0之間的偏差作為考察值：

將每類K串對應(yīng)的考察值v（a1a2…aK）作為分量構(gòu)成一個組分矢量。顯然當(dāng)估計值f0=0時，真值f也為0，此時該維度上的分量設(shè)為0。所有這些分量按照統(tǒng)一的固定順序排列，就得到該物種的組分矢量 V=（v1，v2，…，vm），其中 M=20K。

對于N個物種得到N個這樣的組分矢量Vt，其中是物種的編號，介于1與N之間。它們的遺傳距離矩陣D是一個對角元素為0的N×N對稱矩陣。每個元素對應(yīng)物種間的遺傳距離，由組分矢量的夾角的余弦值給出，其數(shù)學(xué)表達(dá)如下：

最后，基于該遺傳距離矩陣D，使用鄰接法就可以構(gòu)建親緣關(guān)系樹。

1.2 功能實現(xiàn)——CVTree3網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器

1.2.1 基本功能 雖然CVTree的算法本身并不復(fù)雜，但是要從頭實現(xiàn)卻也并不容易，所以我們開發(fā)了CVTree方法的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用戶可以通過互聯(lián)網(wǎng)方便的使用該算法。為了適應(yīng)當(dāng)前基因組數(shù)據(jù)的海量增加，我們開發(fā)了最新的CVTree網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器CVTree3，用戶可以通過 http：//tlife.fudan.edu.cn/cvtree3 訪問。相對于之前的兩個版本的CVTree網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，CVTree3的性能顯著提升。就硬件而言，它專享兩臺具有四路32核、512 G內(nèi)存的高性能計算集群。同時，為了充分利用計算集群的性能，我們重新設(shè)計和編寫了核心程序，實現(xiàn)并行化，還從整體上優(yōu)化了運算過程，從而使效率最大化。此外，為了方便用戶在本地使用CVTree方法進(jìn)行研究，我們還將CVTree3的核心程序單獨抽離出來，做成開源的軟件包。用戶可以從https：//www.github.com/ghzuo/cvtree 下載和編譯本地版本的CVTree程序。

進(jìn)入上述地址即可打開CVTree3首頁。我們提供了一個Example項目，用戶可以在首頁點擊“Example”按鍵，查看和瀏覽這個項目，或者選擇“Load/Create Project”新建一個自己項目。點擊之后即可得到如圖 1所示的項目設(shè)置頁面。對于每個新建的項目，系統(tǒng)自動分配一個由數(shù)字與下劃線組成的項目號并且顯示在頁面頂部（圖 1），若從“Example”按鍵進(jìn)入，則項目顯示為 “example”。在此頁面，用戶可以選擇CVTree方法的基本參數(shù)，如：使用DNA序列還是蛋白質(zhì)序列、短串的長度K（可多選）等。在CVTree3服務(wù)器中，我們內(nèi)置了大量已知分類信息的全基因組，目前包含338種古菌，2 850種細(xì)菌，以及8個真核生物作為外類群備選。用戶在此頁面中部可按類別選擇它們，若想逐條選擇則點擊“See Detail”進(jìn)入逐條選擇頁面。此外，用戶還可以上傳自己的基因組到CVTree3服務(wù)7 d后系統(tǒng)會自動刪除。器，它們顯示在頁面的下部。所有參數(shù)與基因組都設(shè)置好之后，點擊右邊的綠色按鈕“All parameters are fine，Run Project”，即可以提交程序到服務(wù)器上運行了。

用戶不能修改Example項目，若是由“Example”項目進(jìn)入該頁面，點擊該按鍵則不會有反應(yīng)。若只使用內(nèi)建的基因組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)會很快給出結(jié)果；若上傳了自己的數(shù)據(jù)，則需要 等待。等待時間視上傳基因組與選擇的內(nèi)建基因組數(shù)目以及相關(guān)參數(shù)而定。項目在服務(wù)器上運行時，用戶可以關(guān)閉瀏覽器，這不會影響項目的運行。需要查看項目運行情況與計算結(jié)果時，只要使用項目編號從首頁導(dǎo)入該項目即可。用戶也可以選擇在基本參數(shù)選項中填入Email，則當(dāng)項目計算完畢后系統(tǒng)會通知用戶。需要注意的是，每個項目在完成后，只在服務(wù)器上保持7d，

圖1 CVTree3網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的設(shè)置界面頂

1.2.2 親緣關(guān)系與分類的自動比對系統(tǒng) 除了性能的提升，將生成的親緣關(guān)系樹與分類系統(tǒng)進(jìn)行自動比較是CVTree3的又一個亮點。服務(wù)器在運行的過程中，除了使用CVTee算法進(jìn)行親緣關(guān)系的分析以外，還會同時得到的親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)進(jìn)行比較。我們綜合參考了NCBI分類數(shù)據(jù)庫與Bergey’s Manual等數(shù)據(jù)，對內(nèi)建的菌株給出了譜系信息。用戶上傳的數(shù)據(jù)，缺省的信息被設(shè)置為未知（Unclassified）。用戶可以結(jié)合已知的譜系信息來推測未知的分類信息，這也是CVTree3網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的一項重要功能。另外，用戶可以在上傳基因組的方框中上傳分類信息文件，上傳該信息文件的格式與方法請見用戶手冊。

所有的計算都進(jìn)行完畢后，圖 1右上角會顯示藍(lán)色按鈕“See Result”，可以查看計算結(jié)果。首先看到的是一個按照菌株的分類階梯顯示的親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)的對比結(jié)果（圖 2）。在對比親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)的過程中，我們依靠的關(guān)鍵概念是“單源枝（Monophyly）”。所謂單源枝是指，若某個分類單元剛好對應(yīng)著親緣關(guān)系樹上的一個枝， 即分類單元內(nèi)包含的菌株對應(yīng)于該分枝下的所有枝葉所代表的菌株。所以，當(dāng)某個枝為單源時，則說明親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)對于當(dāng)前的數(shù)據(jù)集合是一致的。除了按分類系統(tǒng)顯示單源性，我們還按分類級別統(tǒng)計了單源枝的數(shù)目，分別列在圖 2的兩個未顯示的Tab頁面“Monophyly”與“None”中。圖 2的第4個Tab則列出了一些分類關(guān)系不確定即Unclassified菌株，這些菌株在統(tǒng)計過程中并沒有被計入。

圖2 按分類階梯顯示的單源枝截圖

1.2.3 交互式親緣關(guān)系樹顯示系統(tǒng) 交互式的親緣關(guān)系樹顯示是CVTree3的第3個亮點。點擊圖 2右上角的按鈕“See Tree”即可以看到這棵親緣關(guān)系樹。圖 3是一幅CVTree3親緣樹的截圖，用戶可以從CVTree3的Example中獲得這棵親緣樹，在Web頁面上它是一棵動態(tài)的樹，每個節(jié)點都可以打開或收縮，從而調(diào)整樹的顯示方式。此外，與普通的親緣關(guān)系樹不同，該親緣關(guān)系樹在計算過程中，已自動與分類系統(tǒng)進(jìn)行了比較與標(biāo)記，所以用戶可以方便的從親緣樹查看每個枝的分類屬性。如圖 3所示，我們將樹展開到門的級別，其中的顏色表明，由CVTree方法得到親緣樹在 門的級別上絕大部分與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)保持一致。除此之外，我們還提供了很多方便的操作方式，例如，在親緣樹上搜索自己感興趣的物種與分類單元，系統(tǒng)會根據(jù)用戶要求自動調(diào)整樹的顯示方式，以突出用戶感興趣的內(nèi)容；結(jié)合其它生物學(xué)知識，用戶可以對菌株的譜系屬性試行調(diào)整，系統(tǒng)會根據(jù)新提交的譜系信息重新對比與標(biāo)記親緣關(guān)系樹。CVTree3服務(wù)器還可以輸出高質(zhì)量的圖以供展示和發(fā)表。有關(guān)交互操作的詳細(xì)描述與操作方法可參閱在線手冊。

2 CVTree3 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的應(yīng)用

2.1 對全基因組進(jìn)行分類鑒定

物種親緣關(guān)系與分類具有天然的聯(lián)系，因此CVTree的一個重要應(yīng)用：可以方便地使用親緣關(guān)系對物種進(jìn)行初步鑒定。在CVTree3服務(wù)器中，我們內(nèi)置了大量已知分類信息的全基因組。用戶只需要上傳未知原核生物的全基因組數(shù)據(jù)，將它們和我們內(nèi)置的全基因組數(shù)據(jù)混合生成親緣樹，就可以通過內(nèi)置全基因組的譜系信息來推測上傳的未知菌株的分類地位。

圖3 由CVTree方法得到的親緣樹并根 據(jù)分類信息展開到門一級

圖4 上傳基因組與內(nèi)部基因組的親緣關(guān)系

圖 4所示也是CVTree3中Example的親緣樹。該樹所使用的數(shù)據(jù)集與圖 3相同，通過CVTree3的交互作用，我們讓它更有效的顯示“未知”物種的基因組的分類地位。我們從互聯(lián)網(wǎng)下載了兩個并沒有包含在內(nèi)建數(shù)據(jù)庫之中的全基因組作為“未知”物種來進(jìn)行測試。圖 4中棕色顯示的Kutzneria_albida_DSM_43870.UPLOAD{1}就是其中之一。該“未知”菌株，與Pseudonocardiaceae科的其它幾個屬的菌株同處于一個枝內(nèi)，同時又與它們保持屬一級的獨立性，即與其它幾個屬相互并列。所以我們可以判定，上傳的這個“未知”菌株應(yīng)該是Pseudonocardiaceae科下的一個在CVTree3內(nèi)建數(shù)據(jù)庫中沒有反映的“新”屬。顯然，這與我們從其它渠道了解到的信息，包括它的 命名，是一致的。

2.2 研究種以下的分類情況

基于未知菌株的全基因組序列，使用CVTree3可以對菌株進(jìn)行親緣與分類鑒別研究。雖然使用16S rRNA序列的聯(lián)配也可以進(jìn)行類似的研究，但是由于信息量的限制，使用16S rRNA方很難進(jìn)行種以下的分類單元的研究，這正是CVTree方法的優(yōu)勢所在。由于CVTree方法合理的利用了全基因組信息，它的分辨率顯著高于16S rRNA，從而可以進(jìn)行種以下親緣關(guān)系的研究。下面我們以冰島硫化葉菌（Sulfolobus islandicus）來說明這種應(yīng)用。

圖5 十個冰島硫化葉菌（Sulfolobus islandicus）菌株與其采集地

硫化葉菌是一類極端嗜熱嗜酸古菌，多存在于地?zé)崛⒒鹕綗崛c泥漿噴口處。冰島硫化葉菌因最早發(fā)現(xiàn)于冰島而得名。由于環(huán)境限制，在演化上相對隔絕，所以不同采集地的菌株基因組，具有一些不同的特征。在CVTree3的內(nèi)建數(shù)據(jù)庫中，共收集了10個屬于該物種的菌株，它們來自4個不同的采集地。如圖 5所示，在由CVTree方法建立的親緣關(guān)系也顯著地表現(xiàn)出其采集地的地理位置。首先，來自美洲的4個菌株與來自歐洲的6個菌株分成兩個大枝，然后再根據(jù)其采集地的不同，進(jìn)一步分成為4個較小的分枝。也就是說，從CVTree得到的親緣關(guān)系，有效地反應(yīng)了地理隔絕帶來的演化效果［24］。除了這種由地理位置帶來的種以下的分化外，種以下的分類單元，如亞種、生態(tài)型、血清型、生物變種等，在CVTree構(gòu)建的親緣關(guān)系樹中得以體現(xiàn)的例子，在我們的研究過程中還遇到很多。但是需要說明的是，這些因素之間又會交互影響。例如，相同亞種的不同血清型與相同血清型的不同亞種，對于化膿性鏈球菌在CVTree上有較好的關(guān)聯(lián)，而對于肺炎鏈球菌就不那么清晰，還需要結(jié)合專業(yè)知識有針對性地進(jìn)行研究。

2.3 基于全基因組研究原核生物 分類

在以上兩個例子中，我們使用CVTree方法作為獨立的檢測工具，重現(xiàn)了與其它研究一致的結(jié)果。實際上基于CVTree方法，我們還能對現(xiàn)有的分類系統(tǒng)提供某些新的具有建設(shè)性的意見。例如，大腸桿菌（Escherichia coli）與志賀氏痢疾桿菌（Shigella），這兩類腸道菌在形態(tài)上非常相似，都是革蘭氏陰性桿菌，但是由于志賀氏痢疾桿菌在病理學(xué)上的特異性，它們被單獨分類為一個屬。另一方面，在基于部分基因的分類研究中，各種志賀氏痢疾桿菌常常與埃希氏細(xì)菌屬下的大腸桿菌混雜在一起［25，26］，很多人就據(jù)此認(rèn)為志賀氏痢疾桿菌與大腸桿菌應(yīng)該是同一個種下的不同菌株。

我們用CVTree研究了埃希氏菌屬與志賀氏痢疾桿菌屬。如圖 6所示，所有的志賀氏痢疾桿菌屬的菌株都插入了埃希氏桿菌的屬中，它們與大腸桿菌最靠近，但是也同所有的大腸桿菌分開。所有的志賀氏痢疾桿菌也單獨分開。它們之間的分界也是明確的。這就表明志賀氏痢疾桿菌與大腸桿菌并非同種，它們屬于埃希氏菌屬，是大腸桿菌的姊妹種［27］。這是與目前流行觀念不一致的看法，但它既區(qū)分了志賀氏痢疾桿菌與大腸桿菌，又反映了前者在病理上的特殊性。這說明CVTree的高分辨力對于醫(yī)學(xué)實踐中致病菌的檢測會有所幫助。

3 總結(jié)

當(dāng)前測序技術(shù)的革新帶來了海量的基因組數(shù)據(jù)，為基于全因組數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析提供了豐富素材，同時也對發(fā)展合適的計算工具帶來挑戰(zhàn)。各種計算瓶頸與人為選擇所導(dǎo)致的差異促使我們?nèi)パ芯繜o參數(shù)和不依靠序列聯(lián)配的方法?；谌蚪M的CVTree方法的提出與改進(jìn)，就是在這一前提下的努力結(jié)果。它合理地利用了全基因組的信息，高效地實現(xiàn)了基于全基因組的親緣關(guān)系和分類系統(tǒng)研究。它一方面能與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)保持較好的一致性，另一方面它還提供了研究種以菌株的分辨能力，并且為解決一些具有特殊分類需求的問題提供幫助。我們新開發(fā)的CVTree3網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，運行在并行的高性能硬件上，是一款高效與方便的基于全基因組的親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)的研究工具。它的使用界面非常友好，實現(xiàn)了親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)的自動比較，允許用戶在瀏覽器上進(jìn)行交互式操作。隨著測序技術(shù)的提高，菌株測序的成本不久將低于鑒定它的“濕”實驗的預(yù)算，生物工作者今后不必進(jìn)行太多的鑒定實驗，只要拿到菌株的全基因組，將它提交到CVTree3網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上，就可以對它的分類特性進(jìn)行初步判定。我們更希望，CVTree方法將來能夠成為闡明原核生物親緣關(guān)系與分類系統(tǒng)的定義性的工具。

圖6 志賀氏痢疾桿菌屬（Shigella）與埃希氏菌屬（Escherichia）的親緣關(guān)系樹

致謝：感謝戚繼、徐昭博士對CVTree網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器2004和2009版本的貢獻(xiàn)以及參與CVTree3的討論。感謝復(fù)旦大學(xué)物理系和應(yīng)用表面物理國家重點實驗室資助購進(jìn)用于CVTree3的并行集群系統(tǒng)，使得整個研究項目得以持續(xù)進(jìn)行。

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