針刺對腦出血大鼠血清TNF-a、IL-6含量的影響

陳秋欣,鄒偉,牛明明,劉鵬,姚冬,包宇,孫曉偉

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針刺對腦出血大鼠血清TNF-a、IL-6含量的影響

陳秋欣1,鄒偉2,牛明明1,劉鵬1,姚冬1,包宇1,孫曉偉2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040)

目的 探討針刺對腦出血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及血清TNF-a、IL-6表達(dá)的影響。方法 將72只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組。采用腦內(nèi)自體血注射法制作腦出血大鼠模型。模型成功后,采用百會(huì)透曲鬢針刺法干預(yù),1 d、3 d、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清TNF-a、IL-6含量的變化。結(jié)果 針刺百會(huì)透曲鬢穴可明顯提高大鼠腦出血后神經(jīng)功能評分,減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。同一時(shí)間點(diǎn),針刺組大鼠血清中TNF-a和IL-6含量與模型組比較明顯降低,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。結(jié)論 針刺百會(huì)透曲鬢穴能降低腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損情況,可能與針刺后血清中的TNF-a和IL-6含量降低有關(guān)。

針刺;腫瘤壞死因子;白介素-6;腦出血;大鼠

腦出血是起病較急、病情較重、死亡率高、致殘率高的腦血管疾病。如何積極有效地降低神經(jīng)功能的損傷,降低出血后炎癥反應(yīng),修復(fù)損傷的神經(jīng)元,成為急性腦出血治療的重要內(nèi)容。腦出血后,血腫周圍組織如小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞被激活,釋放腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素-6(IL-1)等炎性因子,誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),加重腦水腫及神經(jīng)元死亡,最終導(dǎo)致腦損傷和神經(jīng)功能缺損加劇。TNF-a是具有多效性的促炎性細(xì)胞因子,而IL-6是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞及B、T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的具有多種生物功能的炎癥細(xì)胞因子。本文擬觀察針刺百會(huì)穴透刺曲鬢穴對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及血清中TNF-a及IL-6含量的影響,探討針刺是否能調(diào)控炎癥反應(yīng)來降低腦出血神經(jīng)功能損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級雄性Wistar大鼠,體重(350±20)g,由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供[證書編號SCXK(黑) 20100027],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度為(22±2)℃,濕度為(50±5)%,氨濃度應(yīng)≤14 rag/m3,噪音＜60 dB。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TNF-a、IL-6試劑盒,購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 腦出血模型建立

參照張國威等[1]和Rosenberg GA等[2]報(bào)道的方法制作腦出血大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定于立體定位儀上,取頭皮正中,備皮消毒,正中切口,骨膜剝離器剝離骨膜,取前囟點(diǎn)(Bregma)點(diǎn)右旁開3.5 mm,后0.2 mm定點(diǎn),用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔,深達(dá)硬腦膜表面,鼠尾乙醇消毒,距尾端3 cm處剪斷鼠尾,用微量注射器取血50mL,將其固定在立體定位儀上,沿鉆孔進(jìn)針約6 mm,將未肝素化的血液50mL以20mL/min速度推進(jìn)腦內(nèi),留針5 min,緩慢出針。留針期間乙醇棉球包扎鼠尾斷端傷口,術(shù)后局部噴灑慶大霉素,用牙科水泥封閉顱骨傷口,縫合頭皮,局部皮膚采用碘酚消毒,防止局部感染影響指標(biāo)觀察。術(shù)后2 h,采用Berderson評分法評價(jià)大鼠的運(yùn)行功能,1～3分者納入本實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

將72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組,每組按1 d、3 d、7 d分為3個(gè)亞組,每組8只。

假手術(shù)組:動(dòng)物接受類似處理組的各項(xiàng)手術(shù)操作,但不進(jìn)行注血制作。

模型組:腦出血模型成功后,不進(jìn)行任何干預(yù)。

針刺組:腦出血模型制備12 h后進(jìn)行針刺干預(yù)。

1.5 針刺方法

參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》,取患側(cè)百會(huì)穴、曲鬢穴,采取百會(huì)穴透曲鬢穴針刺法,用0.35 mm×25 mm毫針針刺,進(jìn)針0.8寸,留針30 min,其間捻轉(zhuǎn)3次,每次5 min,以200轉(zhuǎn)/min速度捻針。

1.6 指標(biāo)檢測方法

1.6.1 神經(jīng)功能評分

采用Berderson評分法測定針刺前后各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度。輕抓尾巴,提高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分為無神經(jīng)功能缺損;1分為腦部病變對側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲,肩內(nèi)收屈曲;2分為上述體征加上向麻痹側(cè)推阻力下降;3分為活動(dòng)時(shí)向麻痹側(cè)打圈(呈追尾狀);4分為不能自發(fā)行走,意識喪失。

1.6.2 血清TNF-a、IL-6含量測定

針刺治療1 d、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后,給予水合氯醛麻醉,將其固定在解剖板上,剪去心前區(qū)被毛,消毒后開胸經(jīng)心臟取血置于離心管中,靜置2 h,5000轉(zhuǎn)/min離心10 min,分離血清,置﹣20℃冰箱中備檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)進(jìn)行TNF-a、IL-6測定,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,全部數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,組間比較采用方差分析,多重比較用或者法,以＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

各組均出現(xiàn)不同程度病灶對側(cè)的偏癱,爬行時(shí)向右側(cè)劃圈,病灶對側(cè)前肢屈曲回收于腹下,癱瘓的后肢向后外展。在1 d時(shí)各組大鼠神經(jīng)功能缺損最為嚴(yán)重,大部分大鼠有追尾現(xiàn)象或表現(xiàn)病灶對側(cè)肢體不能站立,之后神經(jīng)功能缺損程度逐漸減輕。與模型組比較,針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損征有明顯恢復(fù),在1 d和3 d神經(jīng)功能評分均有顯著差異(＜0.01),7 d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征評分比較 (±s,分)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征評分比較 (±s,分)

組別n1 d3 d7 d 假手術(shù)組80.00±0.000.00±0.000.00±0.00 模型組83.08±0.231)2.58±0.151)2.33±0.191) 針刺組82.00±0.172)1.92±0.202)1.50±0.153)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01,3)＜0.05

2.2 各組大鼠血清中TNF-a含量比較

造模后,各時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-a含量較假手術(shù)組明顯增高,其中模型組在1 d、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。經(jīng)過針刺治療后,同一時(shí)間點(diǎn)的針刺組大鼠血清中TNF-a含量明顯下降,針刺組與模型組相比較,1 d、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)差異顯著(＜0.01)。說明針刺可以降低腦出血大鼠血清的TNF-a含量。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-a含量比較 (±s,ng/L)

表2 各組大鼠血清中TNF-a含量比較 (±s,ng/L)

組別n1 d3 d7 d 假手術(shù)組81.34±0.461.89±0.201.41±0.21 模型組83.13±0.401)3.56±0.701)3.21±0.311) 針刺組81.93±0.532)2.41±0.702)2.18±0.702)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.3 各組大鼠血清中IL-6含量比較

造模后,各組大鼠血清中IL-6含量明顯增高,模型組與假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。針刺治療后,針刺組與模型組相比較,同一時(shí)間點(diǎn)的針刺組大鼠血清IL-6含量明顯下降,各時(shí)間點(diǎn)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。說明針刺可以降低腦出血大鼠血清的IL-6含量。詳見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-6含量比較 (±s,pg/L)

表3 各組大鼠血清中IL-6含量比較 (±s,pg/L)

組別n1 d3 d7 d 假手術(shù)組821.56±0.6022.90±0.2321.61±0.59 模型組830.79±0.901)35.02±0.161)30.81±0.261) 針刺組822.59±0.552)25.67±0.602)23.76±0.242)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

4 討論

腦出血發(fā)病機(jī)制目前尚未明確,但與動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)、血脂代謝紊亂、凝血機(jī)制異常等因素有關(guān)。近年來,炎性反應(yīng)在腦出血病理生理機(jī)制中起著重要作用。急性腦出血的病理損傷除局部血腫占位性效應(yīng)及對周圍腦組織的直接破壞作用外,局部和全身炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷的主要組成部分。

炎性因子與腦出血病情發(fā)展呈正相關(guān)[3],TNF-a和IL-6是兩個(gè)重要的炎性因子。IL-6可由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞,有廣泛的生物學(xué)活性,因此參與多種疾病的病理過程,如心肌梗死、糖尿病等[4-5]。腦出血后血腫周圍腦組織中IL-6水平增加,提升炎癥反應(yīng)加重,回歸分析表明血清中IL-6水平是早期腦出血臨床癥狀加重的獨(dú)立因素。Dziedzic T等[6]發(fā)現(xiàn)腦出血患者血清IL-6和C反應(yīng)蛋白水平升高,血清IL-6水平越高,患者的預(yù)后越差。TNF-a是由單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)功能的多肽類細(xì)胞因子,通過抑制纖溶反應(yīng)及活性蛋白C的抗凝作用,刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1),通過與IL-1協(xié)同使內(nèi)皮細(xì)胞表面呈促凝狀態(tài),從而促進(jìn)血栓形成,加重腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[7]。國內(nèi)外研究也表明,TNF-a的高表達(dá)是造成腦出血后血管源性水腫形成的重要原因之一[8-9]。急性腦出血后,血腫周圍組織及血清中TNF-a的表達(dá)都顯著增強(qiáng),提示TNF-a在急性腦出血的炎癥反應(yīng)和腦水腫發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)采用Berderson神經(jīng)體征評分法測定大鼠神經(jīng)功能缺損程度,結(jié)果顯示1 d時(shí)各組大鼠神經(jīng)功能缺損最重,多數(shù)大鼠有追尾現(xiàn)象或表現(xiàn)為病灶對側(cè)肢體不能站立,之后神經(jīng)功能缺損程度逐漸減輕。與模型組比較,針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損征有明顯改善,其各時(shí)間段的神經(jīng)功能評分均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明針刺能顯著改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果,減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。造模成功后,模型組大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量在1 d后開始增加,說明大鼠腦出血后炎性反應(yīng)的存在,并且模型組血清中TNF-a及IL-6的含量與假手術(shù)組比較明顯增高,亦說明腦出血后腦組織中炎癥反應(yīng)增加。針刺治療后,針刺組大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量較模型組減低,1 d、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明針刺能夠有效下調(diào)腦出血大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量,由此,我們推斷針刺能夠減輕腦出血后血清中TNF-a及IL-6的含量,從而減輕腦出血后炎性反應(yīng)所引起的不良后果,從而達(dá)到減輕腦損傷的作用。

綜上,針刺百會(huì)透曲鬢能夠有效降低神經(jīng)功能評分,改善神經(jīng)功能缺損的癥狀,可能與針刺后通過下調(diào)大鼠血清中TNF-a及IL-6的含量,從而減輕腦出血后炎性反應(yīng)有關(guān)。

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Effect of Acupuncture on Serum TNF-aand IL-6 Contents in Cerebral Hemorrhage Rats

CHEN Qiu-xin1, ZOU Wei2, NIU Ming-ming1, LIU Peng1, YAO Dong1, BAO Yu1, SUN Xiao-wei2.

1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine First Hospital,Harbin 150040,China

Objective To investigate the effect of acupuncture on motor function and serum expressions of TNF-aand IL-6 contents in cerebral hemorrhage rats. Method Seventy-two male Wistar rats were randomized into sham operation, model and acupuncture groups. A rat model of cerebral hemorrhage was made by intracerebral injection of autoblood. Baihui-to-Qubin acupuncture was performed after successful model making. The TNF-aand IL-6 contents of rat serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay at three time points: one, three and seven days. Result Baihui-to-Qubin acupuncture markedly increased the neurological function score and reduced neurologic deficits in cerebral hemorrhage rats. At the same time point, serum TNF-aand IL-6 contents were significantly lower in the acupuncture group of rats than in the model and acupuncture group; there were statistically significant differences (＜0.01). Conclusion Baihui-to-Qubin acupuncture can reduce neurologic deficits in cerebral hemorrhage rats. It may be related to decreases in serum TNF-aand IL-6 contents after acupuncture.

Acupuncture; Tumor necrosis factor; Interleukin-6; Cerebral hemorrhage; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.10.1006

1005-0957(2015)10-1006-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273824)

陳秋欣(1985 - ),女,2012級博士生,Email:chenqiuxin0451 @163.com

鄒偉(1965 - ),男,教授,Email:kuangzou2013@sina.com

2015-02-20