胃癌患者Th17/Treg細(xì)胞失衡的研究

李清靖，單保恩，李宏，蘇景偉，張超，李巧霞

胃癌患者Th17/Treg細(xì)胞失衡的研究

李清靖，單保恩，李宏，蘇景偉，張超，李巧霞

目的檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞在胃癌患者外周血中的分布，探討Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法選取2010年7月—2011年9月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院住院的胃癌患者45例作為病例組，另選取同期本院健康體檢者20例作為對(duì)照組。取受試者外周血5 ml，分離單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的表達(dá)，以產(chǎn)生IL－17的為Th17細(xì)胞，以細(xì)胞為Treg細(xì)胞，檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞的數(shù)量和比例。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，病例組外周血Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組中，外周血Th17細(xì)胞比例與Treg細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.64，P=0.003);病例組中，外周血Th17細(xì)胞比例與Treg細(xì)胞比例無直線相關(guān)性(r=0.12，P=0.490)。多元線性回歸分析結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞比例升高與TNM分期(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.017)有關(guān);Treg細(xì)胞比例升高與TNM分期(P=0.034)、分化程度(P=0.015)有關(guān);Th17/Treg升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.036)。結(jié)論胃癌患者Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg明顯增高，并與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)，提示胃癌患者存在Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡失調(diào)，這種失調(diào)可能促進(jìn)了胃癌的進(jìn)展。

胃腫瘤;Th17細(xì)胞;T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性;免疫平衡

李清靖，單保恩，李宏，等．胃癌患者Th17/Treg細(xì)胞失衡的研究［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(29):3596－3600．［www.chinagp.net］

Li QJ，Shan BE，Li H，et al．Imbalance of Th17/Treg in patients with gastric cancer［J］．Chinese General Practice，2015，18(29):3596－3600．

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，每年約有100萬新發(fā)病例，病死率約為50%，其發(fā)病率居全部惡性腫瘤的第3位，居消化道惡性腫瘤的首位。幽門螺桿菌(H.pylori，HP)被定為胃癌的Ⅰ類致癌因子，流行病學(xué)研究表明HP感染與慢性胃炎、胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞在HP感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［1］，大多數(shù)HP感染被體液免疫和細(xì)胞免疫清除［2］。說明免疫調(diào)節(jié)作用在HP介導(dǎo)的致癌作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

根據(jù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其功能，Th17和Treg細(xì)胞被認(rèn)為是不同于Th1和Th2細(xì)胞的細(xì)胞亞群。研究表明Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子在炎癥、自身免疫疾病和過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3－5］。但是Th17細(xì)胞在癌癥中的作用尚不十分清楚。并且，在不同類型腫瘤或不同的機(jī)體免疫背景下，Th17細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著雙向作用。Treg細(xì)胞特征性表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子，是具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群，通過接觸抑制或釋放抗炎細(xì)胞因子白介素10(IL－10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF－β)誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受［6］，這些功能不利于腫瘤免疫監(jiān)視作用和抗腫瘤免疫［7］。

Th17和Treg細(xì)胞之間的平衡控制了免疫應(yīng)答，是輔助性T細(xì)胞作用于自身免疫疾病和移植物抗宿主病的重要調(diào)節(jié)因素［8］。然而，在癌癥患者中關(guān)于Th17和Treg細(xì)胞之間平衡的研究還非常有限。為了評(píng)估在胃癌患者中Th17/Treg平衡是否被打破及其與胃癌發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)系，本研究采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)Th17/ Treg細(xì)胞在胃癌患者外周血中的分布，探討Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年7月—2011年9月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院住院收治的胃癌患者45例作為病例組，其中男36例，女9例;年齡24～74歲，平均年齡44歲?；颊呔?jīng)組織學(xué)證實(shí)，TNMⅠ期15例，Ⅱ期9例，Ⅲ期9例，Ⅳ期12例;高分化14例，低分化31例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例;腫瘤直徑＜4 cm 19例，≥4 cm 26例;浸潤深度＜15mm 17例，≥15 mm 28例;無血管侵襲34例，有血管侵襲11例;無脈管瘤栓36例，有脈管瘤栓9例。排除合并糖尿病、高血壓、心血管疾病、妊娠、急慢性感染、結(jié)締組織疾病和既往其他惡性腫瘤史者?；颊呔葱忻庖咭种啤⒎呕煹戎委?。另選取同期本院健康體檢者20例作為對(duì)照組，其中男13例，女7例;年齡26～65歲，平均年齡41歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離單個(gè)核細(xì)胞取受試者外周血5 ml，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，輕輕顛倒混勻。另外取50 ml離心管，加入ficoll分離液10 ml，將PBS稀釋的外周血輕輕沿管壁滴加到ficoll的液面上，使分界面保持清晰，采用水平離心機(jī)以2 100 r/min離心30 min，離心半徑16 cm，細(xì)胞出現(xiàn)分層:上層為血漿和血小板等，下層主要為紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等，中間為云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，小心吸出云霧狀層面，轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入PBS，混合均勻，采用水平離心機(jī)以1 500 r/min離心10 min，離心半徑16 cm，重復(fù)洗滌1次，棄盡上清液，加入適量含有10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2× 106/m l。

1.2.2 鋪板將調(diào)整好濃度的細(xì)胞培養(yǎng)到24孔板中，每孔1 ml，加入PMA、ionomycin、BFA，使其終濃度分別為50 pg/L、1μg/ml和10μg/ml(PMA和ionomycin是藥理學(xué)的T細(xì)胞活化因子，模擬信號(hào)由TCR復(fù)合物產(chǎn)生，有利于刺激T細(xì)胞的抗原特異性;BFA用來阻止胞內(nèi)運(yùn)輸，因此導(dǎo)致細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)積累)。將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37℃，5%CO2的條件下刺激培養(yǎng)4 h，留待流式標(biāo)記及分析。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞的表達(dá)收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，將細(xì)胞分裝于不同管中，每管100μl，各測(cè)定管分別加入FITC－Anti－Human CD4，同型對(duì)照管加入等量的同型對(duì)照抗體，用于調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償和確認(rèn)抗體的特異性。避光，4℃，孵育30 min進(jìn)行細(xì)胞膜染色;PBS洗滌1次，100μl PBS重懸細(xì)胞，每管加入新鮮配制的Fixation/Permeabilization工作液1 ml，避光，4℃，孵育30～45 min，2 m l 1×Permeabilization Buffer洗滌兩次，測(cè)定管加入PE－Anti－Human IL－17A，同型對(duì)照管加入等量的同型對(duì)照抗體，避光，4℃，孵育30 min，2 ml 1×Permeabilization Buffer洗滌兩次，0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以細(xì)胞設(shè)門分析細(xì)胞中IL－17+細(xì)胞比率。本研究中，每一個(gè)樣本收集分析1×106個(gè)細(xì)胞，Th17細(xì)胞比例以IL－ 17+在細(xì)胞中的百分比表示。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞的表達(dá)收集細(xì)胞裝管同上，各測(cè)定管分別加入FITC－Anti－Human CD4和APC－Anti－Human CD25避光，4℃，孵育30 min染細(xì)胞膜;PBS洗滌1次，100μl PBS重懸細(xì)胞，每管加入新鮮配制的Fixation/Permeabilization工作液1 m l，避光，4℃，孵育30～45 min，應(yīng)用1×Permeabilization Buffer，2 ml洗滌兩次，用正常大鼠血清封閉15 min，測(cè)定管加入PE－Anti－Human Foxp3，同型對(duì)照管加入同等量的PE－rat IgG2a，避光，4℃，孵育30～45 min，2 ml1× Permeabilization Buffer洗滌兩次，0.5 m l PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以細(xì)胞設(shè)門分析細(xì)胞中細(xì)胞比率。本研究中，每一個(gè)樣本收集分析1×106個(gè)細(xì)胞，Treg細(xì)胞比例以在細(xì)胞中的百分比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn);采用Pearson相關(guān)分析Th17與Treg細(xì)胞的相關(guān)性。采用多元線性回歸分析Th17、Treg比例、Th17/Treg與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血中Th17、Treg、Th17/Treg比較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，病例組外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

表1 兩組Th17、Treg細(xì)胞比例以及Th17/Treg比較(±s)Table 1 Comparison of the proportions of Th17 and Treg cells and Th17/ Treg between the two groups

表1 兩組Th17、Treg細(xì)胞比例以及Th17/Treg比較(±s)Table 1 Comparison of the proportions of Th17 and Treg cells and Th17/ Treg between the two groups

組別例數(shù)Th17細(xì)胞比例(%) Treg細(xì)胞比例(%)Th17/Treg對(duì)照組20 1.63±0.10 4.79±0.18 0.34±0.03病例組45 6.67±0.77 10.34±1.13 0.65±0.05 t 值29.04 21.75 25.68 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 相關(guān)性分析對(duì)照組中，外周血Th17與Treg細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.64，P=0.003，見圖1);病例組中，外周血Th17與Treg細(xì)胞比例無直線相關(guān)性(r= 0.12，P=0.490，見圖1)。

2.3 多元線性回歸分析分別以病例組Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg為因變量，以臨床病理特征性別、年齡、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、浸潤深度、血管侵襲、脈管瘤栓、胃癌相關(guān)腫瘤抗原(CA50、CEA、CA199、CA724)為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞比例升高與TNM分期(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.017)有關(guān)，與性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑、浸潤深度、血管侵襲、脈管瘤栓、胃癌相關(guān)腫瘤抗原無關(guān)(P＞0.05，見表2)。Treg細(xì)胞比例升高與TNM分期(P =0.034)、分化程度(P=0.015)有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲、脈管瘤栓、胃癌相關(guān)腫瘤抗原無關(guān)(P＞0.05，見表2)。Th17/Treg升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.036)，與性別、年齡、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、浸潤深度、血管侵襲、脈管瘤栓、胃癌相關(guān)腫瘤抗原無關(guān)(P＞0.05，見表2)。

圖1 Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation between Th17 and Treg cells proportion

3 討論

免疫逃逸在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮決定性的作用［9］。產(chǎn)生免疫逃逸的機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，其中包括T細(xì)胞抑制或功能障礙［10－11］。Th17細(xì)胞為細(xì)胞亞群，在Treg細(xì)胞分化中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［12－16］。有研究在鼠和人類腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞［12，17－18］。但是Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中的性質(zhì)和作用尚不十分清楚。Zhang等［18］發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌和卵巢癌外周血中Th17細(xì)胞明顯增多，另外Th17細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子IL－17血清水平明顯增高。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)胃癌患者中Th17細(xì)胞比例顯著增高，因此，Th17細(xì)胞亞群在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用。近來，CCR4和CCR6被認(rèn)為是Th17細(xì)胞的兩種特征性的趨化因子受體。這些分子的高表達(dá)可能與Th17細(xì)胞在腫瘤中的遷移和定位有關(guān)［19－20］。這些結(jié)果表明外周血Th17細(xì)胞可能是腫瘤浸潤Th17細(xì)胞的重要來源。

最近有證據(jù)表明，IL－17通過上調(diào)多種促血管生成因子［11］，在腫瘤的血管生成和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［21］。Th17細(xì)胞作為IL－17的主要來源［12］，免疫組化研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)Th17細(xì)胞的水平與組織中微血管密度呈正相關(guān)，微血管密度的增加預(yù)示著預(yù)后不良［19］。因此，除了誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受外，腫瘤還可以使促炎性反應(yīng)遠(yuǎn)離抗腫瘤免疫，向血管生成和組織重塑途徑來促進(jìn)腫瘤發(fā)展。本研究中發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞比例的增多與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此，Th17細(xì)胞可能會(huì)間接導(dǎo)致胃癌患者的惡性發(fā)展和存活率降低。Zhang等［22］在胃癌的研究中也得到了相似的結(jié)論。既往研究顯示隨著腫瘤的進(jìn)展，Treg和Th17細(xì)胞逐漸增加，在進(jìn)展期腫瘤中達(dá)到最高水平［22－23］。因此，腫瘤可能會(huì)打破宿主的免疫平衡，使Th17和Treg細(xì)胞比例失衡，向腫瘤區(qū)域運(yùn)輸，并隨著疾病進(jìn)展逐漸積累［3］。因此，局部富含的Treg和Th17細(xì)胞通過誘導(dǎo)免疫抑制和血管生成促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

表2 Th17、Treg細(xì)胞比例和Th17/Treg與胃癌患者臨床病理特征的多元線性回歸分析Table 2 Multivariate linear regression analysis on the influence of clinical pathological features for Th17，Treg and Th17/Treg in gastric cancer patients

Treg細(xì)胞自發(fā)現(xiàn)后，因其對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答有很強(qiáng)的免疫抑制活性，所以在抗腫瘤免疫中得到廣泛關(guān)注［9，24］。越來越多的證據(jù)表明，在癌癥患者中Foxp3+Treg細(xì)胞增多，大量的Treg細(xì)胞導(dǎo)致了患者的低存活率［10，23，25］。本研究證明胃癌患者PBMCs中Treg細(xì)胞比例明顯增高。實(shí)際上，關(guān)于卵巢癌［26］和前列腺癌［27］的研究證明PBMCs中Treg細(xì)胞比例顯著增高，在癌癥早期和進(jìn)展期之間有明顯差別。本研究中Treg細(xì)胞比例增加與胃癌患者臨床分期、腫瘤分化有關(guān)，但是胃癌患者早期和進(jìn)展期Treg細(xì)胞比例有無差異，還需大量的研究證實(shí)。淋巴細(xì)胞的遷移與趨化因子受體密切相關(guān)［19，28－29］。近來研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤相關(guān)的Treg細(xì)胞表達(dá)淋巴回巢因子CD62L，CCR4和CCR6，這些因子誘導(dǎo)Treg細(xì)胞在腫瘤引流淋巴結(jié)和隨著疾病的進(jìn)展逐漸增多［6，10，18，22，27］。提示腫瘤浸潤的Treg細(xì)胞可能來源于外周血。Nakamura等［23］發(fā)現(xiàn)一部分原位癌已經(jīng)具有了免疫調(diào)節(jié)能力，腫瘤細(xì)胞自身開始分泌炎癥趨化因子從外周血中招募Treg細(xì)胞［26］。這一發(fā)現(xiàn)意味著免疫微環(huán)境在胃癌早期可能發(fā)生改變，Treg細(xì)胞比例增高，開始向腫瘤部位運(yùn)輸，隨著腫瘤的發(fā)展逐漸積累。

腫瘤的進(jìn)展是各種類型細(xì)胞相互作用的產(chǎn)物［30］。Th17/Treg亞群與Th1/Th2細(xì)胞亞群均參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)過程［31］，而且Th17/Treg免疫失衡會(huì)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)，結(jié)果顯示，健康人Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)，但胃癌患者兩者無相關(guān)性，這也許反映了在健康人中存在Th17/Treg免疫平衡，但是在胃癌患者中這種平衡被打破。在關(guān)于宮頸癌的研究中也得到了相同的結(jié)論［32］。進(jìn)一步分析顯示，胃癌患者Th17/Treg比例增高與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Th17/Treg失衡可能在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。也有研究報(bào)道了Th17和Treg在人類腫瘤中的不同情況［6，17－18］，Treg細(xì)胞隨著腫瘤的進(jìn)展逐漸增高，但是Th17在早期積累，隨著疾病進(jìn)展逐漸減少，結(jié)果在進(jìn)展期腫瘤中Treg細(xì)胞在Th17/Treg平衡中占主導(dǎo)地位。表明在腫瘤患者中確實(shí)存在Th17/Treg失衡，而且導(dǎo)致存活率下降。在本研究中，隨著腫瘤的進(jìn)展，Th17/Treg細(xì)胞比例逐漸升高，Th17細(xì)胞比例增加比Treg細(xì)胞顯著。這些結(jié)果之間的差異可能是由于不同腫瘤之間的性質(zhì)不同所致。

總之，Th17和Treg細(xì)胞隨著疾病的進(jìn)展逐漸增多，導(dǎo)致在胃癌患者中出現(xiàn)失衡狀態(tài)，提示Th17/Treg失衡在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，更好地理解調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡的潛在機(jī)制，有利于為胃癌提供新的治療方案。

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Imbalance of Th17/Treg in Patients W ith Gastric Cancer

LI Qing－jing，SHAN Bao－en，LI Hong，et al.Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China

Objective To investigate the distribution of Th17 and Treg cells in the peripheral blood of patients with gastric cancer and the relation between Th17/Treg immune balance and gastric cancer．M ethods We enrolled 45 patientswith gastric cancer who were admitted into the Fourth Hospital of HebeiMedical University from July 2010 to September 2011 as case group，and we also enrolled 20 healthy controls who received physical examination in the hospital in the same period as control group.We sampled 5ml peripheralblood from each subjectand extractedmononuclear cells.Flow cytometrywas used to determine the expression ofandT cells that produces IL－17 was taken as Th17 cells，andcells were taken as Treg cells.The numbers and proportions of Th17 and Treg cells were examined．Results Flow cytometry analysis showed that case group was higher(P＜0.05)than control group in the proportions of Th17 and Treg cells proportion and Th17/Treg ratio.In control group，the proportion of Th17 cellsand the proportion of Treg cellswere positively correlated(r=0.64，P=0.003);in case group，the proportion of Th17 cells and the proportion of Treg cells had no linear correlation(r=0.12，P=0.490)．Multipole linear regression analysis showed that the increase of Th17 cells proportion was associated with TNM staging(P=0.002)and lymphatic metastasis(P=0.017);the increase of Treg cells proportion was associated with TNM staging(P=0.034)and differentiated degree(P=0.015);the increase of Th17/Treg was associated with lymphaticmetastasis(P=0.036)．Conclusion Patientswith gastric cancer have higher proportionsof Th17 and Treg cells and Th17/Treg ratio，which is associated with TNM staging，lymphatic metastasis and differentiated degree.Patientswith gastric cancermay have Th17/Treg immune imbalance，which may accelerate the progress of gastric cancer．

Gastric neoplasms;Th17 cells;T－lymphocytes，regulatory;Immune balance

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.29.022

2015－03－07;

2015－08－25)

(本文編輯:賈萌萌)

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2011206086);河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20110456)

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科(李清靖，李宏)，科研中心(單保恩，蘇景偉，張超，李巧霞)

李巧霞，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心;E－mail:hbydsylqx@126.com