燒傷皮膚再生醫(yī)療對糖尿病足ERK1/2和p38信號通路分子的調(diào)控

吳標(biāo)良，唐乾利，覃曉潔，馮烈，王民登，何明杰，呂震

燒傷皮膚再生醫(yī)療對糖尿病足ERK1/2和p38信號通路分子的調(diào)控

吳標(biāo)良，唐乾利，覃曉潔，馮烈，王民登，何明杰，呂震

目的觀察燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù)〔濕潤暴露療法(MEBT)/濕潤燒傷膏(MEBO)〕對ERK1/2和p38信號通路分子表達(dá)的調(diào)控作用，探討MEBT/MEBO對糖尿病足部潰瘍的修復(fù)機(jī)制。方法選擇2013年1月—2014年6月于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的2型糖尿病(T2DM)并發(fā)糖尿病足患者40例，其均按照MEBT/MEBO操作規(guī)程行創(chuàng)面治療。分別留取治療前后肌肉肉芽組織，行免疫組化檢測ERK1/2和p38信號通路關(guān)鍵分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK6)及其底物原癌基因(c－myc)、Akt、活化復(fù)制因子2抗體(ATF2)的表達(dá)情況。結(jié)果患者經(jīng)MEBT/MEBO治療，顯效14例(35.0%)，有效25例(62.5%)，無效1例(2.5%)，總有效率為97.5%(39/40)。治療前后，信號分子(任一信號分子)陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);治療后信號分子ERK1/2、p38、MAPKK6及其底物c－myc、Akt、ATF2陽性表達(dá)率均高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。免疫組化病理結(jié)果顯示，治療前患者創(chuàng)面組織信號分子彌漫分布，治療后患者創(chuàng)面組織信號分子分布范圍較治療前更廣泛。結(jié)論MEBT/MEBO可有效促進(jìn)糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能是參與了ERK1/2和p38信號通路的調(diào)控。

糖尿病足;燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù);MAP激酶信號系統(tǒng);信號通路

吳標(biāo)良，唐乾利，覃曉潔，等．燒傷皮膚再生醫(yī)療對糖尿病足ERK1/2和p38信號通路分子的調(diào)控［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(29):3592－3595．［www.chinagp.net］

Wu BL，Tang QL，Qin XJ，et al．Regulation of burn skin regeneration on ERK1/2 and p38 signaling pathwaymolecules in diabetic foot［J］．Chinese General Practice，2015，18(29):3592－3595．

糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，發(fā)病率逐年升高，花費(fèi)巨大且療效不佳，截肢率較高［1－2］。臨床實(shí)踐已表明，濕潤暴露療法(MEBT)/濕潤燒傷膏(MEBO)對糖尿病足等皮膚難愈性潰瘍有特殊療效［3］。目前研究已證實(shí)，ERK1/2和p38信號通路及其交互作用在傷口愈合中起關(guān)鍵作用［4－5］，本研究擬通過觀察MEBT/MEBO對糖尿病足部創(chuàng)面組織ERK1/2和p38信號通路分子表達(dá)的影響，探討MEBT/MEBO促進(jìn)糖尿病足部創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2013年1月—2014年6月于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的2型糖尿病(T2DM)并發(fā)糖尿病足患者40例，其中男24例，女16例;年齡33～72歲，平均年齡(52.8±11.0)歲;體質(zhì)指數(shù)(BMI)(22.6 ±2.4)kg/m2;糖尿病病程為(8.3±3.7)年;收縮壓(SBP)為(135±12)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa);舒張壓(DBP)為(78±8)mm Hg?；颊咴\斷符合WHO 1999 T2DM及糖尿病足診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。入選患者臨床上無嚴(yán)重的心肝腎疾病、急性腦血管意外、創(chuàng)傷、免疫系統(tǒng)疾病及腫瘤;無精神疾病;近1年內(nèi)未服用類固醇激素類、抗生素等藥物。治療過程中死亡患者予以排除。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 標(biāo)本取材患者常規(guī)創(chuàng)面清創(chuàng)后留取治療前肌肉肉芽組織，并按MEBT/MEBO操作規(guī)范行創(chuàng)面治療:依創(chuàng)面大小取MEBO(北京光明中醫(yī)燒傷創(chuàng)瘍研究所汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)美寶制藥廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20000004)適量制成紗條均勻涂敷于潰瘍面，2次/d，至創(chuàng)面愈合;創(chuàng)面結(jié)痂或壞死組織較多時，可以藥刀結(jié)合逐步清除創(chuàng)面壞死組織，潰瘍創(chuàng)面感染癥狀明顯者換藥前予以過氧化氫溶液、碘伏消毒;治療10～14 d后再次取創(chuàng)面肌肉肉芽組織。同時予常規(guī)控制血糖、血壓和血脂處理，并根據(jù)病情酌情加用改善微循環(huán)、抗感染等治療。

1.3 臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)參考2002年版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［7－8］相關(guān)等級和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，分別為:(1)臨床痊愈:創(chuàng)面愈合或由療效指數(shù)計(jì)算分?jǐn)?shù)為90%～100%;(2)顯效:創(chuàng)面面積縮小明顯，療效指數(shù)為60%～89%;(3)有效:創(chuàng)面面積有所縮小，上皮有生長，療效指數(shù)為30%～59%;(4)無效:創(chuàng)面面積同治療前，亦或較治療前擴(kuò)大，療效指數(shù)＜30%?？傆行?〔(臨床痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)〕×100%，療效指數(shù)=(治療前積分－治療后積分)/治療前積分，積分=面積×50%+傷口疼痛×20%+瘙癢麻木不適×10%+滲出×10%+肉芽組織×10%。

1.4 一般生化項(xiàng)目檢測清晨空腹采集患者外周血3～5 ml，靜置30 min后，以3 000 r/min離心5 min，分離血清，使用高效液相色譜分析法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)，使用IFCC推薦修正法檢測總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)，使用GPO－PAP法檢測三酰甘油(TG)等生化指標(biāo)，由專人使用美國貝克曼COULTER LX20全自動生化分析系統(tǒng)檢測完成。

1.5 組織標(biāo)本免疫組化測定組織標(biāo)本行免疫組化染色，采用多聚合物酶EliVision法進(jìn)行免疫組化測定信號分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK6)及其底物原癌基因(c－myc)、Akt、活化復(fù)制因子2抗體(ATF2)的表達(dá)情況。取材、石蠟切片后，按照immunoway試劑盒說明書進(jìn)行操作。細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)等部位出現(xiàn)褐色沉著為免疫組化陽性反應(yīng)，可為連續(xù)線狀、不連續(xù)點(diǎn)狀彌漫分布。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者生化指標(biāo)檢測患者均能按照規(guī)范完成治療，無中途退出者。經(jīng)生化項(xiàng)目檢測，患者TC為(5.29 ±2.50)mmol/L，TG為(2.23±2.15)mmol/L，LDL－C為(2.60±1.19)mmol/L，HbA1c為(8.0± 2.5)%。

2.2 臨床療效患者經(jīng)MEBT/MEBO治療，顯效14例(35.0%)，有效25例(62.5%)，無效1例(2.5%)，總有效率為97.5%(39/40)。

2.3 治療前后創(chuàng)面信號分子及其底物表達(dá)情況治療前后，信號分子(任一信號分子)陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);治療后信號分子ERK1/2、p38、MAPKK6及其底物c－myc、Akt、ATF2陽性表達(dá)率均高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，見表1)。

表1 MEBT/MEBO治療前后創(chuàng)面信號分子及其底物表達(dá)比較〔n(%)，n=40〕Table 1 Comparison of the expression ofwound surface signalingmolecules and their substrates before and after MEBT/MEBO treatment

2.4 免疫組化病理結(jié)果治療前，患者創(chuàng)面組織信號分子彌漫分布(見圖1A);治療后，患者創(chuàng)面組織信號分子分布范圍較治療前更廣泛(見圖1B)。

圖1 治療前后患者創(chuàng)面組織(×200)Figure 1 Tissue ofwound surface of patients before and after treatment

3 討論

糖尿病足成因復(fù)雜，臨床處理困難，局部創(chuàng)面處理在糖尿病足潰瘍處理中起著重要作用。臨床實(shí)踐表明，傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在去腐生肌、促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面修復(fù)方面有良好效果，且費(fèi)用便宜，MEBO就是其中的代表藥。由MEBO發(fā)展而來的MEBT/MEBO技術(shù)已被公認(rèn)為皮膚難愈性潰瘍創(chuàng)面的經(jīng)典處理方法，其以MEBO為治療藥物，以MEBT為治則，簡稱MEBT/MEBO，最基本的理論指導(dǎo)是“以液化的方式無損傷的排除壞死組織”和“以原位干細(xì)胞培植的方式再生修復(fù)創(chuàng)面”［9］，是當(dāng)代中醫(yī)藥外治燒傷創(chuàng)瘍的重要方法之一。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，其不但對燒傷創(chuàng)面具有作用，而且對糖尿病足、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、神經(jīng)性潰瘍等慢性難愈合性創(chuàng)面的治療，均能取得較好的療效［10－11］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)MEBT/MEBO干預(yù)治療，糖尿病足部創(chuàng)面治療總有效率達(dá)97.5%，再次印證MEBT/MEBO良好的臨床療效。

ERK1/2和p38蛋白激酶屬于MAPK類激酶，研究顯示，ERK1/2和p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中對創(chuàng)面愈合修復(fù)有關(guān)鍵作用［12－13］。p38及ERK1/2信號通路受到抑制或p38信號通路過度激活均可導(dǎo)致傷口延遲愈合或瘢痕形成［4－5］。研究表明，ERK1/2及P38可相互調(diào)控信號通路下游的重要目標(biāo)分子c－myc、Akt及ATF2，共同調(diào)節(jié)傷口愈合的生理過程［14］。本研究使用免疫組化方法觀察ERK1/2和p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵創(chuàng)面信號分子ERK1/2、p38、MAPKK6及其底物c－myc、Akt、ATF2在MEBT/MEBO干預(yù)治療前后的表達(dá)變化，結(jié)果表明，經(jīng)MEBT/MEBO干預(yù)治療后，信號分子ERK1/2、p38、MAPKK6及其底物c－myc、Akt、ATF2陽性表達(dá)率均明顯升高，無論是總體信號分子(任一信號分子)還是具體信號分子陽性表達(dá)率均明顯提高，說明MEBT/MEBO可調(diào)控創(chuàng)面組織ERK1/2和p38信號通路關(guān)鍵分子及其底物的表達(dá)，并通過信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用促進(jìn)創(chuàng)面組織生長，從而促進(jìn)潰瘍的愈合，這可能是其有效促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面潰瘍愈合的機(jī)制之一。

由于倫理學(xué)的限制，本研究無法建立空白對照組(不采取任何治療措施)和其他治療方法組進(jìn)行對比研究，MEBT/MEBO干預(yù)治療的實(shí)際效果評估準(zhǔn)確性有可能受到影響，但本研究結(jié)果也可在一定程度上表明，MEBT/MEBO可有效促進(jìn)糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面愈合，其具體機(jī)制可能是參與了ERK1/2和p38信號通路的調(diào)控。

本文鏈接:

MEBT/MEBO在臨床糖尿病足治療中已應(yīng)用多年，效果良好，但其促進(jìn)糖尿病足部潰瘍愈合的具體機(jī)制尚未完全明確，既往研究已表明ERK1/2和p38信號通路及其交互作用在創(chuàng)面愈合中具有重要作用，本研究以ERK1/2和p38信號通路及其交互作用為切入點(diǎn)，探討MEBT/MEBO促進(jìn)糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制，以服務(wù)于臨床糖尿病防治。

基于目前研究的不足及缺陷，擬在下一步動物模型中開展空白對照研究或與其他治療方法的對比研究，在信號通路研究中采用磷酸化檢測手段及通路抑制等方法進(jìn)一步驗(yàn)證探討MEBT/MEBO促進(jìn)糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

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Regulation of Burn Skin Regeneration on ERK 1/2 and p38 Signaling Pathway M olecules in Diabetic Foot

WU Biaoliang，TANGQian－li，QIN Xiao－jie，et al．Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

Objective To investigate the regulation of moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment (MEBT/MEBO)on the expression of ERK1/2 and p38 signaling pathway molecules in diabetic foot and to study the repair mechanism of MEBT/MEBO therapy on diabetic foot ulcer．M ethods We enrolled 40 patients who were definitely diagnosed with T2DM and diabetic foot in the Endocrinology Department of the Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities and the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine from January 2013 to June 2014．The patientswere all administrated with wound surface treatment by MEBT/MEBO operating process and were administrated with MEBO treatment．Themuscle granulation tissuewas taken before and after treatment，immuno－h(huán)istochemistrywas undertaken to measure the expression of key molecules of ERK1/2 and p38 signaling pathways，including ERK1/2，p38，MAPKK6，cmyc，Akt and ATF2．Results After MEBT/MEBO treatment，14(35.0%)patients saw obvious efficacy，25(62.5%) saw efficacy，and 1(2.5%)saw no efficacy，with a total effective rate of97.5%(39/40)．The positive expression rates of signaling molecules(any signaling molecule)after treatment were significantly different from those before treatment(P＜0.001);the positive expression rates of signalingmolecules，such as ERK1/2，p38，MAPKK6 and its substrate c－myc，Aktand ATF2 after treatment were significantly different from those before treatment(P＜0.001)．The immuno－h(huán)istochemical pathology results showed that the signaling molecules had diffusive distribution on wound surface before treatment，and the distribution area became more extensive after treatment．Conclusion MEBT/MEBO can promote the healing of diabetic foot ulcer，themechanism may be that it is involved in the regulation of ERK1/2 and p38 signaling pathways．

Diabetic foot;Burn skin regeneration technologies;MAP kinase signaling system;Signaling pathway

R 587.29

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.29.021

2015－02－16;

2015－07－26)

(本文編輯:賈萌萌)

2013年國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360547);2013年廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013GXNSFDA019020)

533000廣西百色市，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(吳標(biāo)良，唐乾利，覃曉潔，王民登，何明杰);暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(馮烈);廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(呂震)

唐乾利，533000廣西百色市，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;E－mail:htmgx@163.com。覃曉潔，533000廣西百色市，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;E－mail:yyqinxj@163.com