何首烏二苯乙烯苷對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬組織CA1區(qū)腦啡肽酶及低密度脂蛋白相關(guān)受體1表達(dá)的影響

李小黎，劉曉梅，趙瑞珍，田青

何首烏二苯乙烯苷對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬組織CA1區(qū)腦啡肽酶及低密度脂蛋白相關(guān)受體1表達(dá)的影響

李小黎，劉曉梅，趙瑞珍，田青

目的探討何首烏二苯乙烯苷(TSG)對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織CA1區(qū)腦啡肽酶(NEP)及低密度脂蛋白相關(guān)受體(LRP)－1表達(dá)的影響。方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為A～F組，每組10只。A組為對(duì)照，背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液300 mg/kg，連續(xù)6周，1次/d。B～F組背部皮下注射D－半乳糖300 mg/kg擬阿爾茨海默病(AD)模型，連續(xù)6周，1次/d。造模同時(shí)，C組采用鹽酸多奈哌齊0.9 mg/kg灌胃，D～F組分別給予TSG 0.05、0.10和0.20 g/kg灌胃，連續(xù)12周，1次/d。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠空間記憶能力，前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練大鼠學(xué)習(xí)能力，第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠入水角度及穿越平臺(tái)次數(shù)。采用避暗實(shí)驗(yàn)觀察大鼠被動(dòng)回避記憶功能，第1天進(jìn)行訓(xùn)練，24 h后進(jìn)行測(cè)試，記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)和潛伏期。大鼠麻醉后眼眶取血，采用放射免疫法檢測(cè)血清β淀粉樣蛋白(Aβ)1－42水平。大鼠處死取腦，采用免疫組化染色，以累計(jì)光密度反映海馬CA1區(qū)NEP和LRP－1的表達(dá)水平。結(jié)果各組大鼠入水角度和穿越平臺(tái)次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，B組大鼠入水角度大于A組及C～F組(P＜0.05);B組穿越平臺(tái)次數(shù)低于A組及C～F組(P＜0.05)。各組大鼠潛伏期及遭電擊次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，B組大鼠潛伏期短于A組及C～F組(P＜0.05);B組大鼠遭電擊次數(shù)多于A、E組(P＜0.05)。各組大鼠血清Aβ1－42水平及海馬CA1區(qū)NEP、LRP－1累計(jì)光密度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，B組血清Aβ1－42水平高于A、E、F組(P＜0.05);B組NEP累計(jì)光密度低于A組及D～F組(P＜0.05);B組LRP－1累計(jì)光密度低于A、E組(P＜0.05)。結(jié)論何首烏TSG可改善擬癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高大鼠海馬組織CA1區(qū)NEP、LRP－1的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)Aβ的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)。

阿爾茨海默病;二苯乙烯苷;淀粉樣β肽類;腦啡肽酶;低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白－1

李小黎，劉曉梅，趙瑞珍，等．何首烏二苯乙烯苷對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬組織CA1區(qū)腦啡肽酶及低密度脂蛋白相關(guān)受體1表達(dá)的影響［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(32):3948－3951．［www.chinagp.net］

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阿爾茨海默病(AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，為癡呆中最常見(jiàn)的類型，其臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能降低、行為異常及日常生活自理能力下降。腦內(nèi)以β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為核心的神經(jīng)炎性斑形成是AD重要的特征性病理變化［1］。

Aβ級(jí)聯(lián)假說(shuō)在AD的發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位。該假說(shuō)認(rèn)為，Aβ的產(chǎn)生和清除失衡導(dǎo)致Aβ過(guò)度聚集，產(chǎn)生神經(jīng)毒性損傷神經(jīng)元，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生［2］。腦啡肽酶(NEP)及低密度脂蛋白相關(guān)受體(LRP)－1是主要的Aβ清除蛋白。二苯乙烯苷(2，3，5，4'－四羥基－二苯乙烯－β－D－葡萄糖苷，TSG)是何首烏的主要水溶性成分，具有抗衰老、神經(jīng)保護(hù)等作用，對(duì)AD等神經(jīng)退行性病變的防治具有較好的應(yīng)用價(jià)值［3］。本研究以D－半乳糖建立擬癡呆大鼠模型，觀察TSG對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、血清Aβ水平及海馬CA1區(qū)NEP和LRP－1表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(180 ±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào):SCXK(京)2006—0009。

1.2試劑與儀器D－半乳糖(美國(guó)Sigma公司提供);鹽酸多奈哌齊片〔衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，批號(hào): 081121A，5 mg/片〕;Aβ1－42放射免疫測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，NEP兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，LRP－1兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司)。Morris水迷宮(中國(guó)科學(xué)院藥物研究所);γ－放射免疫計(jì)數(shù)儀(LB2111型，德國(guó)Berthold公司)。

1.3方法

1.3.1分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為A～F組，每組10只。A組為對(duì)照，背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液300 mg/kg，連續(xù)6周，1次/d。B～F組背部皮下注射D－半乳糖300 mg/kg擬AD模型，連續(xù)6周，1次/ d。造模同時(shí)，C組采用鹽酸多奈哌齊0.9 mg/kg灌胃，D～F組分別給予TSG 0.05、0.10和0.20 g/kg灌胃，連續(xù)12周，1次/d。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)采用不銹鋼圓柱形水池，池壁標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn)，即4個(gè)象限，任選1個(gè)象限正中放置直徑為11 cm、高29 cm的平臺(tái)。上方安裝攝像頭與計(jì)算機(jī)相連，記錄大鼠游泳軌跡。(1)定位航行實(shí)驗(yàn):將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入，記錄其在2 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間。如2 min內(nèi)不能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其到平臺(tái)上停留10 s。共進(jìn)行5 d，上、下午各進(jìn)行4次。該實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練大鼠的學(xué)習(xí)能力。(2)空間探索實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)第6天，撤除平臺(tái)，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入，記錄2 min游泳軌跡，采用圖像分析軟件記錄入水角度及穿越平臺(tái)次數(shù)。該實(shí)驗(yàn)反映空間記憶能力。

1.3.3避暗實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠放入明室中，使其進(jìn)入暗室受電擊2次。24 h后進(jìn)行測(cè)試，記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)和潛伏期，潛伏期指大鼠放入明室至首次進(jìn)入暗室并遭電擊的時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)反映被動(dòng)回避記憶功能。

1.3.4血清Aβ1－42及海馬CA1區(qū)NEP和LRP－1水平的測(cè)定大鼠麻醉后立即眼眶取血，以4 000 r/min離心10 min，取血清，采用放射免疫法檢測(cè)Aβ1－42水平，操作方法參照試劑盒說(shuō)明。采用免疫組化染色檢測(cè)NEP和LRP－1表達(dá)。大鼠處死取腦，腦組織投入4%多聚甲醛溶液中固定48 h后行蠟塊包埋及切片，參照Paxinos－Watson圖譜，在bregma點(diǎn)3.8～4.3 mm層面切取海馬組織。組織切片常規(guī)脫蠟至水，以3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源酶活性。枸櫞酸緩沖液微波沸騰抗原修復(fù)5 min，重復(fù)2次，取出冷卻至室溫。分別加入稀釋好的NEP和LRP－1，4℃冰箱過(guò)夜，根據(jù)一抗來(lái)源，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔通用二抗，37℃孵育45 min。DAB顯色劑顯色，鏡下控制染色程度，去離子水終止顯色反應(yīng)后充分沖洗。蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化、返染。梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，以累計(jì)光密度反映海馬CA1區(qū)NEP和LRP－1的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組大鼠入水角度和穿越平臺(tái)次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，B組大鼠入水角度大于A組及C～F組(P＜0.05);B組穿越平臺(tái)次數(shù)低于A組及C～F組(P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1　各組大鼠Morris水迷宮記憶能力比較(±s)Table 1 Comparison of thememory ability in Morriswatermaze test in each group

表1　各組大鼠Morris水迷宮記憶能力比較(±s)Table 1 Comparison of thememory ability in Morriswatermaze test in each group

注:與A組比較，aP＜0.05;與B組比較，bP＜0.05

組別只數(shù)入水角度(°)穿越平臺(tái)次數(shù)(次) A組10 35.53±10.22 6.46±2.16 B組10 54.04±10.91a2.43±1.29aC組10 45.56±12.71b3.29±2.20bD組10 48.57±15.82b3.83±2.35bE組10 42.33±27.17b3.03±2.41bF組10 46.83±14.50b3.67±2.02bF 6.603 5.653 P值值0.006 0.008

2.2避暗實(shí)驗(yàn)各組大鼠潛伏期及遭電擊次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，B組大鼠潛伏期短于A組及C～F組(P＜0.05);B組大鼠遭電擊次數(shù)多于A、E組(P＜0.05，見(jiàn)表2)。

表2　各組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)Table 2 Comparison of the results of step－through test in each group

表2　各組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)Table 2 Comparison of the results of step－through test in each group

注:與A組比較，aP＜0.05;與B組比較，bP＜0.05

組別只數(shù)潛伏期(s)遭電擊次數(shù)(次) 10 10.28±2.10 1.46±0.52 B組10 5.98±1.83a3.43±1.29aC組10 8.33±2.74b2.26±1.07 D組10 6.82±2.11b2.33±0.65 E組10 8.63±2.17b1.73±1.21bF組10 7.83±1.50b2.12±0.88 F A組7.634 4.088 P值值0.003 0.024

2.3血清Aβ1－42及海馬CA1區(qū)NEP、LRP－1表達(dá)水平比較各組大鼠血清Aβ1－42水平及海馬CA1區(qū)NEP、LRP－1累計(jì)光密度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，B組血清Aβ1－42水平高于A、E、F組(P＜0.05);B組NEP累計(jì)光密度低于A組及D～F組(P＜0.05);B組LRP－1累計(jì)光密度低于A、E組(P＜0.05，見(jiàn)表3)。

表3　各組血清Aβ1－42及海馬CA1區(qū)NEP、LRP－1表達(dá)水平比較(±s)Table 3 Comparison of the serum level of Aβ1－42 and the expression ofNEP and LRP－1 in hippocampus CA1 area in each group

表3　各組血清Aβ1－42及海馬CA1區(qū)NEP、LRP－1表達(dá)水平比較(±s)Table 3 Comparison of the serum level of Aβ1－42 and the expression ofNEP and LRP－1 in hippocampus CA1 area in each group

注:Aβ=β淀粉樣蛋白，NEP=腦啡肽酶，LRP=低密度脂蛋白相關(guān)受體;與A組比較，aP＜0.05;與B組比較，bP＜0.05

組別只數(shù)Aβ1－42(pg/ml)NEP累計(jì)光密度LRP－1 10 41.06±11.23 168.06±23.34 825.24±325.44 B組10 66.88±9.05a132.15±25.46a529.11±283.53aC組10 52.93±12.51 148.20±31.01 643.54±315.04 D組10 53.32±10.64 156.84±24.86b667.88±309.83 E組10 47.31±12.41b160.67±28.11b705.39±291.41bF組10 50.45±11.68b155.53±30.58b645.16±264.72 F累計(jì)光密度A組值0.004 0.003 0.033 6.089 6.804 3.829 P值

3　討論

目前，用于老年癡呆研究的動(dòng)物模型有多種，D－半乳糖動(dòng)物模型為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的衰老動(dòng)物模型，近年來(lái)在老年癡呆研究中得到廣泛應(yīng)用。該模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降，腦內(nèi)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)及乙酰膽堿酯酶(AChE)活性降低［4］，血清及海馬Aβ沉積，可模擬AD的行為和病理特征［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，血清Aβ1－42水平顯著升高，提示本實(shí)驗(yàn)造模成功。

AD患者腦內(nèi)Aβ有單體、寡聚體、原纖維等多種形式，其中Aβ寡聚體具有神經(jīng)毒性［6］。Aβ寡聚體形成的基礎(chǔ)在于Aβ水平升高，而Aβ水平升高則是由于Aβ的產(chǎn)生和清除間的平衡障礙。Aβ的清除途徑主要包括3個(gè)方面，即細(xì)胞外降解、細(xì)胞內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)清除出腦［7］。Aβ的降解酶有NEP、胰島素降解酶等。細(xì)胞內(nèi)吞則主要由神經(jīng)元與成纖維細(xì)胞上的清道夫受體和LRP－2完成，但數(shù)量極少。Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)出腦主要通過(guò)LRP－1實(shí)現(xiàn)。根據(jù)Aβ的清除途徑探索減少其在腦內(nèi)聚集的途徑，是AD潛在的治療靶點(diǎn)。本研究主要側(cè)重于TSG對(duì)Aβ的細(xì)胞外降解和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

NEP是位于軸突和突觸膜的Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬中性M13Zn金屬蛋白酶家族，其活性位點(diǎn)朝向膜的胞內(nèi)或胞外側(cè)，該結(jié)構(gòu)有利于降解Aβ及其類似的胞質(zhì)外肽。腦內(nèi)NEP主要由黑質(zhì)紋狀體通路表達(dá)，海馬和大腦皮質(zhì)也有表達(dá)。胞體合成NEP后通過(guò)軸突運(yùn)輸?shù)酵挥|前終末，因此，突觸前終末及鄰近的胞內(nèi)區(qū)可能是NEP降解Aβ的位置。目前研究認(rèn)為，NEP是調(diào)節(jié)致病性的Aβ穩(wěn)態(tài)水平的重要肽酶之一［7］。NEP在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，各種因素(包括年齡、病理過(guò)程)引起NEP活性下降，均可導(dǎo)致其對(duì)Aβ降解能力降低，使Aβ在腦內(nèi)聚集增多，從而引起認(rèn)知功能下降，甚至癡呆的發(fā)生［8］。

LRP－1是一種多功能信號(hào)和清道夫受體，在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。LRP－1通過(guò)其α鏈與組織型纖溶酶原激活物、Aβ前體蛋白、α2－巨球蛋白及載脂蛋白E等多種配體結(jié)合，在腦老化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9］。在Aβ清除過(guò)程中，LRP－1是Aβ經(jīng)血－腦脊液屏障外流最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)體。在生理?xiàng)l件下，Aβ與LRP－1的配體，即α2－巨球蛋白及載體蛋白E結(jié)合成配體復(fù)合物，而后者被微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的LRP－1所識(shí)別，進(jìn)而導(dǎo)致活性通道開(kāi)放，最后使可溶性的Aβ進(jìn)入血液而被清除。隨年齡的增長(zhǎng)，LRP－1表達(dá)進(jìn)行性下降，尤其以海馬區(qū)明顯［10］。LRP－1表達(dá)的下降可加速Aβ在血管壁和腦組織的聚集［11］。研究顯示，AD患者血－腦脊液屏障上LRP－1表達(dá)明顯減少［12］，在AD動(dòng)物模型中，腦內(nèi)LRP－1的嚴(yán)重缺失導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ聚集加倍［13］。

中醫(yī)認(rèn)為，腦為髓之海，腎主骨生髓。故腦髓相通，腎腦相關(guān)。何首烏是常用的補(bǔ)益肝腎中藥，TSG是何首烏中特有的生物活性成分，其含量目前已經(jīng)成為何首烏藥材的專屬性指標(biāo)，其具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化及促智等作用。海馬神經(jīng)元在受到Aβ刺激后，TSG可通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害，下調(diào)自噬蛋白Beclin－1和LC3－Ⅱ的表達(dá)來(lái)抵抗Aβ的神經(jīng)毒性［14］。同時(shí)，對(duì)于Aβ25－31誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)向神經(jīng)元方向分化的趨勢(shì)具有促進(jìn)作用，并能抑制NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，AD模型大鼠海馬組織CA1區(qū)NEP表達(dá)減少，微血管LRP－1的表達(dá)顯著下降。應(yīng)用TSG可提高大鼠海馬組織CA1區(qū)NEP、LRP－1的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)Aβ1－42的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Aβ的聚集和纖維化，從而降低Aβ的神經(jīng)毒性作用。然而，本研究未發(fā)現(xiàn)TSG與大鼠海馬組織CA1區(qū)NEP、LRP－1表達(dá)的劑量關(guān)系，何首烏用于預(yù)防AD及改善AD患者認(rèn)知功能的療效有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯:吳立波)

Influence of TSG on the Learning and M em ory and the Expression of Neprilysin and Low Density Lipoprotein Receptor 1in Hippocampus CA1 Area of Dementia M imetic Rats in Hippocampus CA1 Area of Dementia M imetic Rats

LIXiao－li，LIU Xiao－mei，ZHAO Rui－zhen，et al．The Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective To investigage the influence of TSG on the learning andmemory and the expression of neprilysin (NEP)and low density lipoprotein receptor1(LRP－1)in hippocampus CA1 area of dementiamimetic rats．M ethods Using random number tablemethod，60 ratswere randomly divided into Group A to Group F，with 10 rats in each group．Group A was the control group which was administrated with 0.9%and 300 mg/kg sodium chloride solution by one time per day for 6 weeks consecutively．Group B－F were administrated with back subcutaneous injection of300 mg/kg D－galactose by one time per day for 6 weeks consecutively，in order to build AD models．While building models，Group C underwent gavage by 0.9 mg/kg donepezil hydrochloride，and Group D－F underwent gavage by TSG of0.05，0.10 and 0.20 g/kg respectively by one time per day for 12 weeks consecutively．The space memory ability of the rats were observed by Morris water maze test，during which place navigation testwas undertaken in the first5 days to train the learning ability of rats，and spatial probe testwas undertaken on day 6 to record the angel of entering water and the number of times of crossing platform．Thememory of passive avoidance wasobserved by step－through tests，in which the rats were trained on day 1，and tests were conducted 24 hours later with the number of times of entering dark room and latency period recoded within 5 minutes．Blood was sampled from the eye sockets of the rats after anesthesia，and the serum level of Aβ1－42 was detected using radioimmunoassay．Brains of the ratswere obtained after killing the rats，and after immumohistochemical staining，the expression of NEP and LRP－1 of hippocampus CA1 area were measured by accumulate optical density．Results The groups were significantly different(P＜0.05)in the angle of entering water and the number of times of crossing platform．Group B had bigger angle of entering water than Group A and Group C－F(P＜0.05);Group B had lower number of times of crossing platform than Group A and Group C－F(P＜0.05)．The groups were significantly different(P＜0.05)in latency period and the number of times of receiving electric shock．Group B had shorter latency period than Group A and Group C－F(P＜0.05);Group B has higher number of times of electric shock than Group A and Group E(P＜0.05)．The groups were significantly different(P＜0.05)in the serum Aβ1－42 level and the accumulated optical density of NEP and LRP－1 in hippocampus CA1 area．Group B was higher than Group A and Group E－F in serum Aβ1－42 level(P＜0.05);Group Bwas lower than Group A and Group D－F in the accumulated optical density(P＜0.05);Group B was lower than Group A and Group E in the accumulated optical density of LRP－1(P＜0.05)．Conclusion TSG can significantly improve the learning andmemory of dementiamimetic ratsm，improve the expression of NEP and LRP－1 in hippocampus CA1 area and promote the degradation and transferring of Aβ．

Alzheimer disease;TSG;Amyloid beta－peptides;Neprilysin;Low density lipoprotein receptorrelated protein－1

·醫(yī)學(xué)循證·

R 745.7

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.32.013

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20090013120010)

100029北京市，北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

李小黎，100029北京市，北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院;E－mail:tigerlxl2002@163.com

2015－04－30;

2015－09－28)