人附睪蛋白4在上皮性卵巢癌組織及血清中表達(dá)

周哲，蔣欣，宋繼成（連云港市婦幼保健院婦科，江蘇222000）

人附睪蛋白4在上皮性卵巢癌組織及血清中表達(dá)

周哲*，蔣欣，宋繼成
（連云港市婦幼保健院婦科，江蘇222000）

目的：探討人附睪蛋白4（HE4）在卵巢癌患者組織及血清中的表達(dá)及臨床意義。方法：選取卵巢癌患者40例、卵巢良性腫瘤30例及對(duì)照組30例，用免疫組化法檢測(cè)組織中HE4蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中HE4水平。結(jié)果：HE4在卵巢癌組患者的血清及組織中的表達(dá)高于卵巢良性腫瘤及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。術(shù)前HE4血清水平與卵巢上皮癌患者的病理類型（r=0.25，P=0.022）、組織學(xué)分級(jí)（r=0.43，P=0.001）、臨床分期（r=0.51，P=0.001）、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=0.22，P=0.027）均呈正相關(guān)；與年齡無(wú)相關(guān)性（P=0.124）。結(jié)論：檢測(cè)卵巢癌組織及血清中HE4水平，可作為卵巢癌診斷、評(píng)價(jià)其惡性進(jìn)展的參考指標(biāo)，可用于指導(dǎo)臨床綜合治療。

卵巢癌；人附睪蛋白4；免疫組織化學(xué)法；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

[Abstract]Objective:To research on the appearance in tissue and serum and the clinical significance of human epididymis protein 4(HE4)in patients with ovarian cancer.Methods:This research was based on the treated cases of 40 patients with ovarian cancer and 30 cases of benign ovarian tumor and 30 cases of normal control group from January,2011 to October,2013 in Lianyungang Maternal and Child Health Care Hospital.Results:The appearance of HE4 in the serum and tissue ovarian cancer patients was higher than that of benign ovarian tumor and normal control group,and the difference was statistically significant（P<0.01）；the positive appearance rate of Ovarian tissue HE4 was statistical significance in the pathological type,clinical stage,histological grade and lymph node metastasis（P<0.05）.Conclusions:The appearance of HE4 in Ovarian cancer tissue and serum is associated with the extent and the degree of illness,which can be used as a diagnosis to the auxiliary early stage ovarian cancer.It can also be used as a mark of curative effect and the index of reference for prognosis evaluation and to guide the clinical comprehensive treatment.

[Key words]ovarian cancer;human epididymis protein 4;immunohistochemistry;enzyme linked immunosorbent assay

卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌居第3位，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率均有上升趨勢(shì)，其致死率卻占居首位。這主要是因?yàn)槁殉舶┰缙诎Y狀不明顯，只有19%的卵巢癌患者在癌組織突破卵巢之前能夠被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，且容易腹腔轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。卵巢癌被世界衛(wèi)生組織列為早期發(fā)現(xiàn)可提高治愈率的一類疾病。卵巢癌早期治療5年生存率可達(dá)92%，然而晚期卵巢癌5年生存率不足50%[1]，因此尋找理想的生化指標(biāo)用于卵巢癌早期診斷與治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一種新的盆腔惡性腫瘤標(biāo)志物，近來(lái)受到人們的關(guān)注。本文對(duì)我院2011年1月—2013年10月收治手術(shù)卵巢上皮性疾病70例患者，對(duì)其中卵巢癌40例患者組織及外周血血清中HE4的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并與卵巢良性囊腫及正常組織進(jìn)行對(duì)照比較,以探討其在卵巢癌中的臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料卵巢上皮性疾病70例患者根據(jù)術(shù)后病理學(xué)診斷分為2組：（1）卵巢癌組40例，年齡19～71歲，平均（52.0±14.7）歲。其中漿液性乳頭狀囊腺癌20例，子宮內(nèi)膜樣癌13例，移行細(xì)胞癌2例，透明細(xì)胞癌3例，黏液性乳頭狀囊腺癌2例。按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2000年手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)：早期（I~Ⅱ）14例，晚期（Ⅲ~Ⅳ）26例；低中分化23例，高分化17例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。住院后均接受卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后予紫杉醇+卡鉑方案規(guī)范化療。（2）卵巢良性腫瘤組30例，年齡22~68歲，平均（48.0±12.7）歲。成熟畸胎瘤11例、漿液性囊腺瘤8例、黏液性囊腺瘤6例、卵巢巧克力樣囊腫5例，均行卵巢腫瘤剝除術(shù)。同時(shí)選擇30例因其他疾病行卵巢切除術(shù)，術(shù)后病理診斷正常卵巢組織為對(duì)照組。所有入選患者術(shù)前經(jīng)相關(guān)檢查已排除高血壓、冠心病、肝腎功能異常、甲狀腺、乳腺腫瘤等疾病，所有患者入院后經(jīng)常規(guī)知情告知并征得其同意后方采血留樣。

圖1　卵巢癌組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HE4強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（SP法，200×）

1.2方法（1）血清檢測(cè)：患者入院當(dāng)天及術(shù)后1個(gè)月采取清晨空腹肘正中靜脈全血3mL，置于未加抗凝劑的真空采血管中，保存在4℃冰箱，3天內(nèi)離心3000r/min，10～15min后取上清，分裝在聚丙烯EP管內(nèi)。應(yīng)用血清HE4 ELISA試劑盒（瑞典康乃格），用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA雙抗體夾心法）檢測(cè)。正常參考值為0~150pmol/L。（2）組織學(xué)觀察：組織標(biāo)本取自術(shù)中卵巢癌新鮮組織，以10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片4～5μm厚，常規(guī)HE染色觀察腫瘤組織學(xué)改變。（3）檢測(cè)組織中HE4蛋白：采用MaxVisonTM快捷免疫組化法，即用型兔抗人HE4多克隆抗體（北京中杉金橋公司），即用型快捷免疫組化MaxVisonTM試劑盒及DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)公司）。用已知陽(yáng)性附睪組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定采用半定量積分法：①按顯色深淺評(píng)分：0分，不顯色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。②按顯色比例評(píng)分：1分，顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)<25%；2分，顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)25%～50%；3分，顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)51%～75%；4分，顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)>75%。最后以兩者乘積得分值作為判定標(biāo)準(zhǔn)：≤2分為陰性（-）；＞2分為陽(yáng)性（+）。

圖2　卵巢良性囊腫組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HE4弱陽(yáng)性表達(dá)（SP法，200×）

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血清HE4水平呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)及范圍表示總體水平，組間比較用秩和檢驗(yàn)。卵巢癌組織中HE4陽(yáng)性表達(dá)率采用χ2檢驗(yàn)。變量之間的相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3　卵巢正常組織中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HE4陰性表達(dá)（SP法，200×）

2　結(jié)果

2.1HE4在各組組織中的表達(dá)卵巢癌組HE4陽(yáng)性32例（80.0%），卵巢良性腫瘤組HE4陽(yáng)性4例（13.3%），正常卵巢對(duì)照組HE4陽(yáng)性0例。HE4在卵巢癌組（圖1）表達(dá)水平分別與卵巢良性腫瘤組（圖2）及正常卵巢對(duì)照組（圖3）相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；卵巢良性腫瘤組與正常卵巢對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2HE4在各組血清中的表達(dá)血清HE4水平在卵巢癌組(術(shù)前)分別高于卵巢良性腫瘤組及正常卵巢對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。卵巢癌組HE4水平術(shù)前高于術(shù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。卵巢良性腫瘤組與正常卵巢對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3卵巢癌患者術(shù)前血清HE4水平與臨床病理關(guān)系變量間相關(guān)性分析結(jié)果顯示：術(shù)前HE4血清水平與卵巢上皮癌病理類型（r=0.25，P=0.022）、組織學(xué)分級(jí)（r=0.43，P=0.001）、臨床分期（r=0.51，P=0.001）、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=0.22，P=0.027）均呈正相關(guān)；與患者是否絕經(jīng)無(wú)相關(guān)性（P=0.124），見(jiàn)表2。

2.4卵巢癌組織中HE4表達(dá)與不同臨床病理特征關(guān)系卵巢癌組織中HE4表達(dá)陽(yáng)性率在卵巢漿液性和內(nèi)膜性癌顯著高于其他病理類型者（P<0.01）；III~IV期卵巢癌顯著高于I~II期者（P<0.05）；中低分化卵巢癌顯著高于高分化者（P<0.05）；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移者（P<0.05）。而HE4表達(dá)陽(yáng)性率與年齡大小比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

表1　HE4在各組血清中的表達(dá)（pmol/L）

表2　卵巢癌患者術(shù)前血清HE4水平與病理關(guān)系（pmol/L）

表3　卵巢癌組織中HE4表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系（例，%）

3　討論

人附睪蛋白4基因最早是由Kirchhoff等[1]在人附睪上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，該基因位于染色體20q12~ 13.1上，分泌小分子糖蛋白。研究發(fā)現(xiàn)HE4可能作為檢測(cè)早期卵巢癌的理想標(biāo)志物，是婦科盆腔良惡腫瘤鑒別診斷的良好指標(biāo)。2005年Drapkin等[2]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析,HE4蛋白表達(dá)在生殖系統(tǒng)和呼吸上皮被抑制，大多數(shù)的非卵巢腫瘤不表達(dá)HE4。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）顯示出卵巢癌細(xì)胞表達(dá)HE4。同時(shí)分析出HE4在100%的卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、93%的卵巢漿液性癌和50%的卵巢透明細(xì)胞癌中表達(dá)，但在卵巢粘液性癌及正常卵巢組織中不表達(dá)，可作為卵巢癌診斷的指標(biāo)之一。HE4基因在卵巢癌組織中高表達(dá)，在正常卵巢組織中不表達(dá)或低表達(dá)，因此該基因可能是一個(gè)卵巢癌相關(guān)基因，該基因的啟動(dòng)子可能是一個(gè)卵巢癌特異性的啟動(dòng)子。Bignotti等[3]對(duì)卵巢惡性腫瘤患者HE4蛋白表達(dá)和血清HE4水平研究結(jié)果顯示：在卵巢惡性腫瘤患者組織和血清中，HE4血清和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯上調(diào)。高水平HE4顯著降低整體生存率、無(wú)疾病進(jìn)展存活率和無(wú)瘤生存期。高水平HE4是進(jìn)展型卵巢惡性腫瘤的表現(xiàn)形式，其可作為低分化類型卵巢惡性腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究顯示：卵巢癌組組織及血清中HE4表達(dá)與卵巢良性腫瘤組及對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且卵巢癌組術(shù)前血清HE4水平高于術(shù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

目前認(rèn)為卵巢癌預(yù)后不良的因素有：年齡>60歲，國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期III~IV期，組織學(xué)分級(jí)III級(jí)，非漿液性病理類型[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)：高HE4血清水平與漿液性卵巢癌病理類型及組織學(xué)分級(jí)差相關(guān)。不滿意的卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)后患者和盆腹腔有轉(zhuǎn)移病灶者HE4水平均明顯升高[5]。本研究顯示：卵巢癌組織中HE4表達(dá)陽(yáng)性率在病理類型、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與患者年齡是否超過(guò)60歲無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。國(guó)內(nèi)外研究也提示：HE4在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率，均隨著卵巢癌的病理分級(jí)增高而顯著增加,臨床分期愈晚表達(dá)愈高,有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者[6]。與FIGO分期、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者年齡無(wú)相關(guān)。HE4在卵巢癌組織的表達(dá)水平隨病理分期升高而增高，與術(shù)前血清HE4水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果表明卵巢癌組織中HE4表達(dá)與病變范圍、病情程度有關(guān)，在一定程度上反映卵巢癌患者臨床進(jìn)展情況。因?yàn)榻M織中HE4表達(dá)與血清中HE4水平正相關(guān)，所以血清中HE4水平同樣能反映卵巢癌進(jìn)展。

綜上所述，組織和血清中HE4的檢測(cè)對(duì)卵巢癌診斷、療效評(píng)價(jià)及評(píng)估腫瘤的惡性進(jìn)展方面具有一定意義，作為卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物在臨床診斷中具有一定參考價(jià)值。

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[6]郭冰沁，俞嵐，武世伍，等.HE4、NF-κBp65和MMP-9在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2011，20（6）：578-583.

The appearance in tissue and serum of human epididymis protein 4(HE4) in patients with ovarian cancer

ZHOU Zhe,JIANG Xin,SONG Jicheng
(Department of Gynaecology,Lianyungang Maternal and Child Health Hospital,JiangSu 222000)

R737.31

A

1006-2440（2015）02-0117-04

周哲，女，漢族，江蘇連云港人，生于1968年3月，本科，主任醫(yī)師。研究方向：婦科腫瘤。

2014-11-10