MicroflexTM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對腸桿菌科細(xì)菌鑒定能力的比較

劉 瑛，俞 靜，陳 峰，劉婧嫻，李媛睿，皇甫昱嬋，沈立松

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092)

近年來，革蘭陰性桿菌在臨床微生物樣本中的分離率已＞70%，超過革蘭陽性菌，其中三分之二又為腸桿菌科細(xì)菌[1-2]。腸桿菌科細(xì)菌與人類關(guān)系密切，隨著創(chuàng)傷性診療技術(shù)的廣泛開展以及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，由腸桿菌科細(xì)菌引起的醫(yī)院感染逐年上升。因此，臨床對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定需求不斷增加。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確地鑒定此類細(xì)菌，對于感染性疾病的診斷和治療具有重要意義。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)用于分析非揮發(fā)性生物大分子，已運(yùn)用于微生物領(lǐng)域，尤其在菌株鑒定方面。本研究利用MicroflexTMMALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(簡稱Vitek 2 Compact)同時(shí)對545株腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行鑒定，若兩者鑒定結(jié)果不一致，再用沙門菌血清凝集試驗(yàn)或細(xì)菌16S rDNA基因測序予以確認(rèn)。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室以往參加衛(wèi)生部和上海市臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控菌株以及2013年3至12月從各類臨床樣本分離得到的腸桿菌科細(xì)菌，共545株。

2.儀器和試劑 Vitek 2 Compact及配套的革蘭陰性桿菌鑒定卡(GN)購自法國BioMérieux公司，MicroflexTMMALDI-TOF MS儀和 α-氰基-4-羥基肉桂酸購自德國 Bruker Daltonics公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購自德國Eppendorf公司，ABI Prism 310 Genetic Analyzer DNA測序儀購自美國Applied Biosystems公司，PCR擴(kuò)增試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)公司，基因測序擴(kuò)增試劑盒購自美國 Applied Biosystems公司，Bruker Bacterial Test Standard(BTS)、乙腈、三氟乙酸、乙醇和甲酸購自美國SIGMA公司，沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，麥康凱及SS平板購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司。

二、方法

1.Vitek 2 Compact鑒定 挑取平板上純菌落，制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙?，用Vitek 2 Compact及其配套的GN鑒定板進(jìn)行鑒定。

2.MALDI-TOF MS儀鑒定 (1)參數(shù)設(shè)置:線性操作模式，正離子，基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式。脈沖離子提取時(shí)間:100 ns。相對分子質(zhì)量:2000～20000;(2)制備樣本:取待測樣本(1個(gè)菌落)，加入 300 μL去離子水和900 μL乙醇，于Eppendorf離心管中充分混勻，離心后干燥沉淀，加入70%甲酸水溶液(1～80 μL)，充分混勻，加入等量的乙腈，充分混勻，20817×g離心2 min，取上清1 μL，滴加到 MALDI靶板上，室溫晾干。1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液覆蓋上述樣本點(diǎn)，室溫晾干;(3)上機(jī)分析:靶板上機(jī)用flexcontrol軟件作質(zhì)譜分析，先用標(biāo)準(zhǔn)品(BTS)進(jìn)行系統(tǒng)誤差校正，再進(jìn)行待測樣本的質(zhì)譜分析。使用MALDI Biotyper 3.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)比對，評分≥1.7表示樣本圖譜與數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)菌株圖譜高度相似，結(jié)果高度可信。本研究均選取評分≥1.7的結(jié)果作為待測樣本的鑒定結(jié)果。

3.血清凝集試驗(yàn) 沙門菌的血清凝集試驗(yàn)具體操作方法見《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[3]。

4.基因測序 采用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA，以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用細(xì)菌16S核糖體通用引物序列16S rDNA(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')[4]，PCR 體系配置按試劑盒說明書進(jìn)行，PCR程序?yàn)?94℃3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，割取含1500 bp左右清晰DNA條帶的瓊脂凝膠塊，用DNA膠回收試劑盒回收其中的PCR產(chǎn)物作為測序單向PCR反應(yīng)的模板，單向PCR反應(yīng)的具體體系與擴(kuò)增程序參考BigDye Terminator v3.1測序試劑盒操作手冊。單向PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過回收后使用310測序儀進(jìn)行測序得到DNA序列，通過NCBI網(wǎng)站BLAST工具進(jìn)行DNA序列比對分析，得到菌株所屬分類。

結(jié) 果

一、3種腸桿菌科細(xì)菌的質(zhì)譜鑒定圖譜

大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌等3種臨床最常見的腸桿菌科細(xì)菌的質(zhì)譜鑒定圖譜見圖1。3種腸桿菌科細(xì)菌有相同的特征峰，如4365、5381和7158 amu，大腸埃希菌和陰溝腸桿菌相同的特征峰為6254 amu，也有各自特異的特征峰，大腸埃希菌特異的特征峰2689和5096 amu等，肺炎克雷伯菌特異的特征峰3146、4740、6290、7706 和 9482 amu 等，陰溝腸桿菌特異的特征峰3128、5122、7690、8331 和9511 amu等。

圖1 3種常見腸桿菌科細(xì)菌的質(zhì)譜圖

二、MicroflexTM MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果

545株細(xì)菌中鑒定到種、屬的分別為529株(97.1%)和16株(2.9%)。除了 6株腸桿菌屬細(xì)菌和10株沙門菌屬細(xì)菌被鑒定到屬外，其余菌株均被鑒定到種。見表1。

三、Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果

545株細(xì)菌鑒定到種、群、屬的分別有454株(83.3%)、76 株(13.9%)、12 株(2.2%)，另有 1株(0.2%)鑒定錯(cuò)誤，2株(0.4%)未鑒定出。其中鑒定到群的細(xì)菌有腸桿菌屬(54株)、沙門菌屬(10株)、變形桿菌屬(8株)、沙雷菌屬(3株)和耶爾菌屬(1株)。鑒定到屬的細(xì)菌有腸桿菌屬(1株)、枸櫞酸桿菌屬(1株)、拉烏爾菌屬(6株)和泛菌屬(4株)。鑒定錯(cuò)誤的是1株非脫羧萊克勒菌，未能鑒定出的是2株大腸埃希菌。見表1。

四、MicroflexTM MALDI-TOF MS和 Vitek 2 Compact鑒定比對

545株腸桿菌科細(xì)菌中有83.3%(454/545)在2個(gè)系統(tǒng)中鑒定結(jié)果一致且均鑒定到種水平。鑒定結(jié)果不一致的91株細(xì)菌中，75株細(xì)菌被MicroflexTMMALDI-TOF MS系統(tǒng)正確鑒定到種水平，而Vitek 2 Compact則僅能將其中76株細(xì)菌鑒定到群水平。見表2。

表1 MicroflexTM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact對腸桿菌科細(xì)菌鑒定結(jié)果比較

續(xù)表1

表2 MicroflexTM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果對比 [株(%)]

討 論

腸桿菌科細(xì)菌是一類分布廣泛且常見的醫(yī)院感染病原菌，可引起泌尿道及傷口感染、血流感染、肺炎、腦膜炎等，受到臨床日益關(guān)注。目前，在醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中，腸桿菌科細(xì)菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要有手工板條法和儀器法，儀器法中以Vitek 2 Compact最為常見，它們都是依據(jù)細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行鑒定，時(shí)間長且成本高。MALDI-TOF MS技術(shù)作為一種新型的微生物鑒定方法，依據(jù)特征性蛋白圖譜進(jìn)行分類和鑒定，已在微生物領(lǐng)域尤其細(xì)菌鑒定中得到廣泛運(yùn)用[5-11]。

本研究采用 MicroflexTMMALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact同時(shí)對545株腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果不符的菌株用沙門菌血清凝集試驗(yàn)或細(xì)菌16S rDNA基因測序予以確認(rèn)。這2種儀器對細(xì)菌種的鑒定符合率分別為97.1%和83.3%。在Vitek 2 Compact數(shù)據(jù)庫中，由于陰溝腸桿菌、霍氏腸桿菌和路德維希腸桿菌包括在陰溝腸桿菌復(fù)合群，普通變形桿菌和潘氏變形桿菌同屬一個(gè)復(fù)合群，液化沙雷菌和小腸結(jié)腸耶爾森菌分別歸于液化沙雷菌群和小腸結(jié)腸耶爾森菌群，導(dǎo)致這些細(xì)菌只能鑒定到群;同樣由于數(shù)據(jù)庫原因，分散泛菌只能被鑒定到屬。而MicroflexTMMALDI-TOF MS儀數(shù)據(jù)庫中包含的腸桿菌科細(xì)菌參考圖譜種類比Vitek 2 Compact細(xì)菌數(shù)據(jù)庫多，因此，前者對這些細(xì)菌都能正確鑒定到種。在14株沙門菌株中，MicroflexTMMALDI-TOF MS對豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌能直接鑒定到種，Vitek 2 Compact則對甲型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和腸炎沙門菌亞利桑那亞種直接鑒定到種，其余菌株都只能鑒定到屬或群，需用沙門菌血清凝集試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。有2株大腸埃希菌在Vitek 2 Compact上未能鑒定出，分析其原因可能由于其菌落特別黏稠，不易制備成均勻的菌懸液，致使其不能準(zhǔn)確鑒定。由于MicroflexTMMALDITOF MS數(shù)據(jù)庫中志賀菌屬的數(shù)據(jù)缺乏，因此，本研究不包括志賀菌屬的鑒定結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，MicroflexTMMALDI-TOF MS對于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定符合率高于Vitek 2 Compact。隨著方法改進(jìn)和數(shù)據(jù)庫完善，MicroflexTMMALDI-TOF MS對細(xì)菌的鑒定符合率將進(jìn)一步得到提高，而且其操作簡便、快速，成本低，可以滿足臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對腸桿菌科細(xì)菌的快速鑒定需求，為臨床進(jìn)行有效、及時(shí)的抗感染治療提供幫助。

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