結(jié)核病快速早期診斷技術(shù)研究進(jìn)展

（云南省玉溪市江川區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，玉溪 652600）

1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法

痰液涂片及痰結(jié)核菌培養(yǎng)試驗(yàn)是結(jié)核病的主要細(xì)菌學(xué)檢測(cè)鑒定方法。除傳統(tǒng)羅氏法，目前國(guó)內(nèi)利用氧猝滅熒光原理研發(fā)的BACTEC MGIT 960熒光免疫系統(tǒng)可以快速指示培養(yǎng)管中分支桿菌耗氧量與熒光顯示的關(guān)系，經(jīng)熒光強(qiáng)度記憶探測(cè)器測(cè)定，數(shù)據(jù)經(jīng)處理后出結(jié)果[1]。BACTEC MGIT 960分枝桿菌系統(tǒng)較傳統(tǒng)的羅氏法對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本的分離率顯著提高，可有效防止病原菌的漏檢、誤檢，其陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間提前更加明顯，但由于該系統(tǒng)試劑的價(jià)格昂貴，在臨床上推廣不現(xiàn)實(shí)。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

2.1 抗原檢測(cè)

結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，機(jī)體內(nèi)便會(huì)產(chǎn)生結(jié)核抗原，如何檢測(cè)出結(jié)核抗原便能直接反映感染的存在，因此檢測(cè)結(jié)核抗原具有早期診斷價(jià)值[2]。TST是目前常用的結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)注射PPD到動(dòng)物機(jī)體后觀察注射部位是否產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)作為判斷是否感染，但其結(jié)果會(huì)因個(gè)體差異而出現(xiàn)假陽(yáng)性。而國(guó)外有文獻(xiàn)記載利用了酶鏈免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)可以有較高的靈敏度和特異度的間接檢測(cè)到結(jié)核菌特異性抗原，從而達(dá)到了早期快速診斷結(jié)核病的目的[3]。ELISPOT是結(jié)核病的重要輔助檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可以提高診斷準(zhǔn)確率，明確預(yù)防性治療的對(duì)象[4]。

2.2 抗體檢測(cè)

目前，各類免疫色譜卡在結(jié)核病早期快速診斷中得以廣泛應(yīng)用，其中，由日本進(jìn)口的Capilia TB的快速免疫色譜卡效果比較突出，它主要檢測(cè)的是在結(jié)核菌群的培養(yǎng)中分泌到菌體外的蛋白質(zhì)MPB64，且該蛋白質(zhì)只在結(jié)核分枝桿菌中產(chǎn)生，所以有很強(qiáng)的特異性，高親和力的抗體流經(jīng)抗原線時(shí)只與特異性抗原結(jié)合，因此Capilia TB成為快速準(zhǔn)確診斷結(jié)核分枝桿菌的技術(shù)手段[5]。在20世紀(jì)90年代，臨床醫(yī)學(xué)主要采用DIGFA診斷結(jié)核病，檢測(cè)所使用的斑點(diǎn)反應(yīng)板包被有固相結(jié)核分支桿菌PPD純化抗原，痰液中的抗結(jié)核分支桿菌抗體(PPD-IgG)會(huì)與這種斑點(diǎn)反應(yīng)板上的抗原形成復(fù)合物，該復(fù)合物再與SPA或IgG結(jié)合，會(huì)產(chǎn)生紅斑點(diǎn)，該技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，適合推廣應(yīng)用于衛(wèi)生、防疫等部門。蛋白質(zhì)芯片(Protein Chip,PC)[6]技術(shù)作為一種新型高通量的蛋白功能分析技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片可以對(duì)宿主體內(nèi)多而復(fù)雜抗原譜在表達(dá)的數(shù)量或種類隨個(gè)體免疫背景和病程而表現(xiàn)出的抗體譜差異很大情況下篩選藥物作用的蛋白靶點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，并檢測(cè)多個(gè)結(jié)核抗體白質(zhì)，有效提升結(jié)核病診斷的陽(yáng)性率，這在結(jié)核病早期快速診斷中有著重要的意義。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但在臨床實(shí)際操作中經(jīng)常呈現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性、污染等狀況，因此像逆轉(zhuǎn)錄PCR、nPCR、Real-time PCR等改進(jìn)后更準(zhǔn)確及高靈敏度的診斷技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。Real-time PCR利用TaqMan熒光探針在擴(kuò)增時(shí)插入一對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性引物和一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光雙標(biāo)記探針，該探針為一寡核苷酸，兩頭各標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)(Fam)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱計(jì)算PCR產(chǎn)物[7]。由于Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性的意義僅僅提示標(biāo)本含有結(jié)核分枝桿菌核酸，因此結(jié)合濃縮涂片法可以直觀的看見(jiàn)細(xì)菌，對(duì)Real-time PCR陽(yáng)性的病例進(jìn)行確認(rèn)，可有效提高特異性，具備快速、精確、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，可推廣用于結(jié)核病的初期診斷、快速篩查。

3.2 DNA指紋技術(shù)

DNA指紋技術(shù)是通過(guò)特異性核酸探針與結(jié)核桿菌基因組雜交后利用內(nèi)切酶酶切片段，經(jīng)電泳得到特異性的譜帶。國(guó)內(nèi)有學(xué)者采取IS6110限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(IS6110．RFLP)、寡核苷酸分型(Spoh-gotyping)及多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列解析(MLVA)3種分型對(duì)40株結(jié)核分枝桿分別獨(dú)立解析，并對(duì)3種分型方式的結(jié)果舉行了對(duì)比，結(jié)果為：采取IS6110-RFLP手藝可以將40株菌分成35種基因型，此中33株結(jié)核分枝桿菌具備特異的基因型，占82.5%(33/40)。其余7株只有2種基因型，占17.5%(7/40)，全部都是IS61 10單菌株。這說(shuō)明該方法在菌株級(jí)別對(duì)單拷貝的IS6110的菌株的鑒定效果不佳。采取Spoligotyping分型方式可以將40株菌分成17種基因型，此中11株具備特異的基因型，對(duì)7株IS6110單拷貝的菌株可以分為6個(gè)基因型。而采取MLVA分型方式可以將40株菌分成34種基因型，各型的VN-TR指紋圖譜各異，呈現(xiàn)出顯著的基因多態(tài)性。有29株結(jié)核分枝桿菌具備特異的基因型，占72.5%(29/40)。剩余11株菌表現(xiàn)出7種基因型，占27.5%(11/40)。這表明，Spoligotyping分型方式在菌株級(jí)別鑒定時(shí)的精準(zhǔn)度低于IS6110-RFLP和MLVA。而如果將這3種方法結(jié)合起來(lái)對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定，其效果顯著高于這3方法各自單獨(dú)利用時(shí)的效果，40株結(jié)核分枝桿菌可以分成39種基因型，只有2株菌沒(méi)有分離。因此，可將MLVA方法作為結(jié)核分枝桿菌的一線分型方法，Spoligotyping技術(shù)作為補(bǔ)充，而IS6110．RFLP作為二線的分型方法[8]。從而克服結(jié)核桿菌在分型、追蹤和尋覓傳染源、內(nèi)源性復(fù)發(fā)和外源性再感染或重感染中傳統(tǒng)研究的局限性，具有重要的早期快速診斷意義。

4 分子雜交技術(shù)

分子雜交是由單鏈核酸與探針按照堿基配對(duì)手段經(jīng)同位素、生物素等標(biāo)識(shí)后進(jìn)行鑒別。利用DNA探針雜交檢測(cè)分支桿菌，可直接在硝酸纖維膜上點(diǎn)樣，用結(jié)核桿菌DNA探針進(jìn)行雜交，具有較高的特異性，同時(shí)用酶呈色觀察結(jié)果，使雜交信號(hào)得以放大同時(shí)提高了菌型鑒定的敏感性，縮短了檢測(cè)時(shí)間[9]。近年來(lái)雜交技術(shù)對(duì)耐藥分支桿菌進(jìn)行分型的研究較為成熟，其中發(fā)夾DNA探針就是一種新型結(jié)核病初期快速診斷的方法。它利用核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)規(guī)律構(gòu)建的莖環(huán)布局DNA探針，對(duì)耐藥結(jié)核菌單堿基檢測(cè)具備很強(qiáng)的靈敏性和特異性。相關(guān)研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌對(duì)鏈霉素等氨基糖甙類藥物的耐藥性主要是由白核糖體卵白S12編碼基因rpsL和16sRNA編碼基因rrs的突變引起的，而發(fā)夾DNA探針檢測(cè)耐藥性便是操縱結(jié)核分枝桿菌耐藥性與基因突變有關(guān)機(jī)制，檢測(cè)其與耐藥性相干的突變位點(diǎn)，判定結(jié)核分枝桿菌的耐藥性， 該技術(shù)對(duì)單個(gè)堿基的錯(cuò)配、缺失或插入突變具備較高的檢出率，不失為一種快速精準(zhǔn)的診斷方法。

5 展望

就現(xiàn)代醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展的今天來(lái)看，目前結(jié)核病的早期快速診斷方法很多，可以適應(yīng)不同條件、不同層次的工作需要。但這些檢測(cè)和診斷方式還不敷完美。但隨著臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展和技術(shù)改進(jìn)，相信未來(lái)會(huì)必然找到快速、精準(zhǔn)、特異的結(jié)核病初期診斷方式，使結(jié)核病可以及時(shí)診斷和治療。

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