乳清中淀粉樣蛋白A與奶牛隱性乳房炎相關性研究

尹柏雙　王秋竹　付連軍等

摘要：為研究不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病與乳清中淀粉樣蛋白A（SAA）含量變化的關系。選取8頭健康奶牛和24頭患輕、中、重度隱性乳房炎奶牛為試驗動物，采集乳樣，分離乳清，利用Elisa SAA檢測試劑盒測定樣品中SAA含量。結果表明，隨著隱性乳房炎病情加重，乳汁體細胞數的增加，乳清中SAA含量逐漸升高，與健康對照組相比差異呈顯著或極顯著（P﹤0.01或P﹤0.05）。結果表明，乳清中SAA含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關性，乳腺損傷程度和乳汁體細胞數增加與乳清中SAA含量呈正相關。

關鍵詞：奶牛；隱性乳房炎；乳清；淀粉樣蛋白

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3705-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.032

Abstract： In order to study on relationship recessive mastitis of dairy cows with amyloid protein A in the whey. 8 healthy cows and 24 cows with light， moderate， severe recessive mastitis were randomly divided into 4 groups. To collect milk and separate whey， SAA content was detected by Elisa SAA kit. The results showed that the content of the SAA in whey was increased significantly with the aggravation of recessive mastitis， increase the milk somatic cell count， compared with the healthy control group（P﹤0.01 or P﹤0.05）. The results indicated that the change of the SAA content in whey with recessive mastitis incidence has certain correlation， degree of breast injury and increase of milk somatic cell counts were positively correlated with the SAA content in whey.

Key words： cows； recessive mastitis； whey； amyloid protein

奶牛隱性乳房炎可引起奶牛產奶量下降，牛奶品質降低，養(yǎng)殖成本增加，產后發(fā)情延長，妊娠時間推遲，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失，是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的疾病之一[1]。血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A，SAA）是一類多基因編碼的多形態(tài)蛋白家族，屬于急性期反應蛋白，炎癥或感染急性期SAA迅速升高，在疾病的恢復期迅速下降[2，3]。研究發(fā)現，SAA在細菌感染時升高[4]；在微弱的炎癥刺激時SAA可作為輕微炎癥刺激的判定指標[5]。奶牛隱性乳房炎發(fā)病與微生物感染、機械性和物理性損傷引起的乳腺炎性反應密切相關，本試驗研究乳清中SAA與不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病的關系，為隱性乳房炎快速診斷方法的建立提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 通過乳汁體細胞計數監(jiān)測后將年齡、胎次、產奶量、泌乳期等指標相近的健康奶牛8只和患不同程度奶牛隱性乳房炎奶牛24只，由吉林市某奶牛場提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 淀粉樣蛋白A（SAA）測定試劑盒購于南京建成生物試劑研究所；Fossmatic 5000型體細胞計數儀（FOSS 公司，丹麥）；Varioskan 酶標儀（Thermo 公司，美國）；離心機（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 通過乳汁體細胞計數監(jiān)測后將試驗奶牛分成健康對照組（8只，SCC﹤10×104 個/mL）、輕度隱性乳房炎組（8只，50×104個/mL﹤SCC﹤150×104個/mL）、中度隱性乳房炎組（8只，150×104個/mL﹤SCC﹤500×104個/mL）、重度隱性乳房炎組（8只，SCC>500×104個/mL）。

1.2.2 乳樣采集 采集試驗奶牛的乳汁，采樣前對乳區(qū)進行清洗，然后用70%的酒精消毒乳區(qū)，棄掉頭3 把乳汁，分別采乳10 mL裝入無菌試管中，將采集的乳樣放到冰盒中，帶回實驗室檢測。

1.2.3 乳清制備 將采集的乳樣3 000 r/min離心5 min，除去上層乳脂，然后于16 000 r/min高速離心機中離心10 min，去除沉淀，保留上清液，4 ℃保存，待測。

1.2.4 檢測方法 乳汁體細胞計數采用體細胞計數儀測定，淀粉樣蛋白A（SAA）含量采用SAA Elisa試劑盒測定，在酶標儀上450 nm 比色測定OD值，根據試劑盒說明繪制標準曲線后計算SAA含量。

1.2.5 數據處理 采用SPSS 17.0數據分析系統(tǒng)做單因素方差分析，結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 乳清中淀粉樣蛋白A（SAA）標準曲線及回歸方程

通過ELISA SAA檢測試劑盒檢測5個濃度梯度的SAA的OD450 nm，利用ELISA Calc回歸/擬合軟件進行分析。由圖1可知，擬合直線回歸方程為：Y=0.184 33X+0.001 08，r2=0.999 4，濃度與吸光值線性回歸良好，表明該方法檢測樣品值可信度較高。

2.2 乳清中淀粉樣蛋白A（SAA）含量

由表1和圖2可知，患輕度乳房炎奶牛乳清中SAA含量為（3.88±0.57） μg/mL，與健康對照組比較升高顯著（P﹤0.05）；患中、重度乳房炎奶牛乳清中SAA含量較健康對照組顯著升高（P﹤0.01）。隨著乳房炎病情加重，乳汁體細胞數增加，乳清中SAA含量逐漸升高，表明乳腺損傷程度和乳汁體細胞數增加與乳清中SAA含量呈正相關。

3 討論

SAA主要由肝細胞合成與降解，機體受到炎癥、感染、損傷等刺激后產生白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等一系列細胞因子，調控SAA的合成[4，6-8]。肝內合成的SAA釋放入血后，迅速與高密度脂蛋白（HDL）結合[9]，參與內毒素的解毒以及膽固醇的代謝和轉移[10]、抑制免疫反應[11]、誘導前列腺素I2的合成等多種生理、病理反應[12]。有研究表明，奶牛在發(fā)生炎癥反應時血清SAA表達量在急性炎癥時大量增加，乳房炎發(fā)病時血清中SAA含量發(fā)生改變[13]。呂英等[14]報道，人工感染金黃色葡萄球菌引起山羊隱性乳房炎時，血清SAA在感染后血清中的濃度急劇升高，乳中SAA較感染前顯著升高。楊永新等[15，16]報道，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌性乳房炎奶牛血漿中SAA的表達量增加。楊洪森[17]研究表明，家兔乳頭管灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌后引起乳房炎家兔血清中SAA的表達量增加。

本研究表明，患隱性乳房炎奶牛乳清中SAA含量較健康組顯著升高，且隨著乳房炎病情加重，乳清中SAA含量逐漸升高。究其原因可能與奶牛乳房炎發(fā)病時乳汁中體細胞數量、IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α含量增加，調控SAA合成增多相關，且隨著乳房炎病牛癥狀加劇，IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α含量逐漸增加，SAA合成也隨著增多[18，19]。乳清中SAA含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關性，隨著乳腺損傷程度的加劇、乳汁體細胞數的增加、炎性細胞因子含量的增多，乳清中SAA含量顯著升高。

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