氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉致腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的建立

張悅，田潔，田新宇，湯新逸，楊珺，耿麗娜，馬潔，許化溪，王勝軍（江蘇大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉致腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的建立

張悅，田潔，田新宇，湯新逸，楊珺，耿麗娜，馬潔，許化溪，王勝軍
（江蘇大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

目的：建立腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的小鼠模型。方法：給予小鼠單次小劑量腹腔注射氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）聯(lián)合2％葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulpate，DSS）自由飲用，建立腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型。對照組小鼠給予 PBS腹腔注射后普通飲水。每天觀察癥狀，2％DSS 5 d，普通飲水16 d，此21 d為1個循環(huán)，共進行4個循環(huán)，結(jié)束后，斷頸處死小鼠，取脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、結(jié)腸，觀察并比較兩組小鼠脾臟，腸系膜淋巴結(jié)大體改變和結(jié)腸 HE染色情況。結(jié)果：與對照組比較，實驗組小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)明顯增大，結(jié)腸遠端出現(xiàn)腫瘤。HE染色結(jié)果顯示，實驗組發(fā)病小鼠結(jié)腸黏膜層及黏膜下層出現(xiàn)廣泛的炎癥細胞浸潤，腺體組織結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，出現(xiàn)腺管樣結(jié)構(gòu)，具有組織異型性。結(jié)論:單劑量 AOM與 DSS聯(lián)合使用可在短期內(nèi)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。

氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸鈉；結(jié)腸癌；動物模型

［Abstract］Objective:To establish a mice model of colitis associated cancer.Methods:The colitis associated cancer was induced by a single intraperitoneal injection of 12.5 mg/kg azoxymethane（AOM）and stepped by four cycles oral administration of 2％dextran sodium sulpate（DSS）.The occult blood was observed everyday.At the end of the fouth cycle，the mice were killed for observing the spleen，mesenteric lymph nodes，colon；colon tissues were harvested for mucosa morphological changes under light microscopy.Results:Compared to the control group，the spleens，mesenteric lymph nodes were enlarged and the tumorigenesis was found in distal colon in the experiment group；and there were a lot of inflammation cell infiltration and dysplasia in colon.Conclusion:Administration of AOM combined with DSS could induce a mice model of colorectal cancer in a short period.

［Key words］azoxymethane；dextran sodium sulpate；colorectal cancer；animal model

炎癥性腸病與結(jié)直腸癌密切相關(guān)［1］。雖然只有1％～2％直結(jié)腸癌患者是由炎癥性腸病發(fā)展而來，但炎性腸病遷延30年后超過18％的患者會發(fā)展為結(jié)直腸癌，是導(dǎo)致炎性腸病患者死亡的常見原因［2］。盡管近幾年結(jié)直腸癌的臨床研究有了較大的進展，但對于其發(fā)病機制仍不清楚，需要進一步深入研究，為此，建立合適的動物模型是必不可少的。氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）是一種用于建立嚙齒類動物模型常用的致癌劑，其作用機制主要為烷化 DNA造成堿基錯配進而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［3-4］；葡聚糖硫酸鈉 （dextran sodium sulpate，DSS）作為一種促炎藥物，溶解于小鼠的飲水中，可引發(fā)嚴重的以血性腹瀉為主要特征的腸炎［5］，長期反復(fù)接觸可發(fā)生慢性腸炎。本研究應(yīng)用小劑量特異的結(jié)腸致癌劑 AOM聯(lián)合 DSS建立腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌小鼠模型，通過觀察相關(guān)癥狀和結(jié)腸病理切片來研究小鼠結(jié)直腸疾病的發(fā)展［6］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗小鼠 12只雄性C57BL/6小鼠，6周齡，體質(zhì)量 20克（揚州大學(xué)實驗動物比較中心）。動物合格證號:SCXR（蘇）2007-0001。

1.1.2 主要試劑 AOM購自美國 Sigma公司，DSS購自美國MP Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 12只實驗小鼠隨機均分為對照組（6只）和實驗組（6只）。實驗組腹腔注射12.5 mg/kg AOM并給予2％DSS水溶液自由飲用5 d；繼以普通飲水，16 d。此21 d為1個循環(huán)，共進行4個循環(huán)。對照組給予 PBS腹腔注射后普通飲水。造模中第27，48，69，90天為第1至第4個循環(huán)的最后一天。

1.2.2 結(jié)腸炎臨床觀察 整個實驗過程中每個循環(huán)的最后一天測體質(zhì)量；2％DSS開始飲用時至飲用結(jié)束當天及開始普通飲水 7 d后，每天觀察是否存在肉眼可見血便，檢測糞便是否出現(xiàn)隱血。

1.2.3 病理檢查 在造模第4個循環(huán)結(jié)束后，小鼠斷頸處死，取脾臟及腸系膜淋巴結(jié)，分離肛門至回盲部連接處整段大腸。量取大腸長度，垂直剖開后生理鹽水沖洗。肉眼觀察后浸入10％甲醛緩沖液固定（pH=7.2）。常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，讀片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用 SPSS 11.5進行統(tǒng)計分析，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本 t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠糞便隱血及體質(zhì)量的變化

實驗組小鼠于腹腔注射AOM后第1次飲用2％DSS水溶液后第 5天，67％（4/6）出現(xiàn)隱血或肉眼血便，在隨后正常飲水的第12天隱血癥狀消失；在第2，3，4個循環(huán)中飲用 2％DSS后分別有 67％ 4/6），50％（3/6），33％（2/6）小鼠出現(xiàn)隱血或肉眼血便。

在第1至第4個循環(huán)的最后一天（即第27，28，69，90天），稱量兩組小鼠體質(zhì)量。結(jié)果顯示，實驗組小鼠體質(zhì)量增加較對照組緩慢，平均體質(zhì)量低于對照組。見圖1。

圖1 兩組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 小鼠結(jié)腸、脾臟及腸系膜淋巴結(jié)大體形態(tài)

與對照組比較，實驗組小鼠在結(jié)腸遠端可觀察到誘發(fā)的腫瘤，腸壁明顯變厚，脾臟及腸系膜淋巴結(jié)明顯腫大。見圖2。

圖2 兩組小鼠結(jié)腸、腸系膜淋巴結(jié)及脾臟大體形態(tài)

2.3 小鼠結(jié)腸組織學(xué)改變

對照組小鼠腺體排列整齊，實驗組 82％（5/6）小鼠結(jié)腸黏膜層及黏膜下層出現(xiàn)廣泛的炎癥細胞浸潤，癌組織侵入黏膜層，腺體組織結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，出現(xiàn)腺管樣結(jié)構(gòu)，具有組織異型性。見圖3。

3 討論

圖3 兩組小鼠結(jié)腸組織 HE染色結(jié)果（×10）

嚙齒動物模型可模擬結(jié)直腸癌的多種特征，是研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展?jié)撛跈C制的重要手段［6］；同時，也是研究臨床預(yù)試驗和新治療方法不可缺少的工具。AOM誘導(dǎo)出腫瘤的高發(fā)部位位于結(jié)腸遠端，與人類結(jié)直腸癌的發(fā)病特點相似。在此模型中，DSS起到促炎癥反應(yīng)作用；嚙齒類動物飲用 DSS水溶液可產(chǎn)生腸上皮毒性，表現(xiàn)為以血性腹瀉為特征的腸炎。DSS的劑量選擇也是造模成功與否的關(guān)鍵因素之一，過高會導(dǎo)致小鼠在造模過程中大量死亡，而過低則無法誘導(dǎo)出腸癌。本實驗采用2％DSS對于結(jié)直腸癌模型的建立較為合適。

本研究給予小鼠單次小劑量腹腔注射 AOM聯(lián)合4個循環(huán) 2％DSS自由飲用建立潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌小鼠模型，共90 d，期間觀察小鼠相關(guān)癥狀的變化。實驗組小鼠與對照組小鼠相比，體質(zhì)量增加緩慢，到了循環(huán)后期差距越來越明顯，此為實驗組小鼠發(fā)生早期的腸炎與后期所發(fā)展的腸癌帶來的后果。通過對小鼠在疾病發(fā)展過程中隱血及肉眼便血的動態(tài)觀察可以發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠前 2個循環(huán)中急性腸炎的癥狀突出，在第4個循環(huán)結(jié)束時，結(jié)腸遠端出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，呈典型的腺癌樣結(jié)構(gòu)。雖然其他誘癌劑也可用于建立該模型，如二甲肼，但AOM具有溶解劑型的穩(wěn)定性優(yōu)勢，且誘導(dǎo)結(jié)腸癌的重復(fù)性好［7-8］。以 AOM聯(lián)用1個DSS循環(huán)可模擬急性腸炎誘發(fā)的腸癌［9-10］。而本研究中采用AOM聯(lián)用4個 DSS循環(huán)，由于 DSS的反復(fù)刺激造成慢性腸炎，故誘導(dǎo)出慢性腸炎相關(guān)性腸癌。AOM聯(lián)用4個DSS循環(huán)與聯(lián)用1個DSS循環(huán)相比，產(chǎn)生的腫瘤更高發(fā)，且腫瘤生長速度更快［9，11］。

綜上所述，本研究中AOM聯(lián)用 DSS誘導(dǎo)的腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌動物模型與人類結(jié)直腸癌在癥狀和病理變化上高度相似，且方法簡單，實驗動物易獲得，不僅可用于疾病發(fā)生機制的研究，還可用于臨床預(yù)防及治療的研究。

［1］Dyson JK，Rutter MD.Colorectal cancer in inflammatory bowel disease:what is the real magnitude of the risk［J］？World J Gastroenterol，2012，18（29）:3839-3848.

［2］Herszenyi L，Miheller P，Tulassay Z.Carcinogenesis in inflammatory bowel disease［J］.Dig Dis，2007，25 （3）:267-269.

［3］Adams SV，Ahnen DJ，Baron JA，et al.Survival after inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer in the Colon Cancer Family Registry［J］.World J Gastroenterol，2013，19（21）:3241-3248.

［4］Papanikolaou A，Shank RC，Delker DA，et al.Initial levels of azoxymethane-induced DNA methyl adducts are not predictive of tumor susceptibility in inbred mice［J］. Toxicol Appl Pharmacol，1998，150（1）:196-203.

［5］Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice［J］.Gastroenterology，1990，98（3）:694-702.

［6］Corpet DE，Pierre F.How good are rodent models of carcinogenesis in predicting efficacy in humans？A systematic review and meta-analysis of colon chemoprevention in rats，mice and men［J］.Eur J Cancer，2005，41 （13）:1911-1922.

［7］Moriya M，Harada T，Shirasu Y.Inhibition of carcinogenicities of 1，2-dimethylhydrazine and azoxymethane by pyrazole［J］.Cancer Lett，1982，17（2）:147-152.

［8］Rosenberg DW，Liu Y.Induction of aberrant crypts in murine colon with varying sensitivity to colon carcinogenesis［J］.Cancer Lett，1995，92（2）:209-214.

［9］Becker C，F(xiàn)antini MC，SchrammC，et al.TGF-β suppresses tumor progression in colon cancer by inhibition of IL-6 trans-signaling［J］.Immunity，2004，21（4）: 491-501.

［10］Okayasu I，Ohkusa T，Kajiura T，et al.Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis［J］.Gut，1996，39（1）:87-92.

［11］Baek SJ，Okazaki R，Lee SH，et al.Nonsteroidal antiinflammatory drug-activated gene-1 over expression in transgenic mice suppresses intestinal neoplasia［J］. Gastroenterology，2006，131（5）:1553-1560.

Establishment of AOM/DSS induced a mice model of colitis associated cancer

ZHANG Yue，TIAN Jie，TIAN Xin-yu，TANG Xin-yi，YANG Jun，GENG Li-na，MA Jie，XU Hua-xi，WANG Sheng-jun
（Institute of Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

R735.3

A

1671-7783（2015）01-0019-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y140109

國家自然科學(xué)基金資助項目（31170849）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK2011472）

張悅（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:sjwjs@ujs.edu.cn

2014-04-18 ［編輯］劉星星