葡萄二倍體與四倍體雜交胚挽救技術(shù)中珠被處理方式的研究

陳三春 ，張 娜 ，武書哲 ，田淑芬

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心，天津 300192；3.天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

選育優(yōu)質(zhì)無(wú)核葡萄是現(xiàn)代葡萄育種的研究熱點(diǎn)。20世紀(jì)80年代以前的無(wú)核品種中，70%左右都是通過(guò)有性雜交獲得的，即以無(wú)核品種做父本，有核品種做母本雜交組合中選育出來(lái)的，這種選育無(wú)核葡萄品種的方式預(yù)選困難且效率低下。1982年美國(guó)育種學(xué)家Ramming和Emershad[1]改變了傳統(tǒng)育種模式，創(chuàng)立了無(wú)核胚挽救技術(shù)，利用胚挽救技術(shù)，雖然可以進(jìn)行無(wú)核與無(wú)核品種之間的雜交，但親本選擇范圍較小。三倍體育種為無(wú)核葡萄育種開辟了新途徑，即采用二倍體和四倍體雜交獲得三倍體后代，三倍體具有高度不育性，從而提高后代無(wú)核效率，三倍體育種是獲得大粒無(wú)核葡萄的重要育種途徑，但仍存在著植株形成率低，技術(shù)不完善等問題。

本研究以玫瑰香優(yōu)系（歐亞種，二倍體，該優(yōu)系適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)、抗病性強(qiáng)，天津市農(nóng)科院葡萄研究中心通過(guò)分子標(biāo)記和田間選種結(jié)合的方法鑒別篩選出，較普通玫瑰香品種香氣濃郁，果穗松緊度適中，果粒均勻）為母本，以戶太8號(hào)和巨峰為父本，通過(guò)雜交進(jìn)行玫瑰香型大粒無(wú)核葡萄的篩選，研究取樣時(shí)期、剝胚和剪喙不同處理方式對(duì)兩種雜交組合胚挽救的影響，為三倍體育種技術(shù)提供參考。

1 試材與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014～2015年在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為玫瑰香與戶太8號(hào)雜交胚珠、玫瑰香與巨峰雜交胚珠。

1.2 方法

在初花期采集父本的花粉，花前3～4d母本去雄，柱頭上開始分泌粘液時(shí)授粉，以24h為間隔連續(xù)授粉3次。自葡萄授粉后35d起，每隔10d調(diào)查1次胚珠發(fā)育狀況，即隨機(jī)取15粒果實(shí)，稱其漿果單粒重，然后剝開果實(shí)取出胚珠，稱取胚珠的平均重量并統(tǒng)計(jì)漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)，連續(xù)取樣3次，將取樣果粒在自來(lái)水中洗凈后，置于超凈工作臺(tái)上，先用75%的酒精浸泡45s，無(wú)菌水沖洗1次，再在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡3min，無(wú)菌水沖洗3次。切開漿果，取出胚珠，接種在培養(yǎng)基上。

1.2.1 雜交果實(shí)胚珠重量、胚珠數(shù)量變化觀察

取玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的果粒，每個(gè)取樣時(shí)期隨機(jī)選取15粒果實(shí)，稱其漿果單粒重，然后剝開果實(shí)取出胚珠，稱取胚珠的平均重量并統(tǒng)計(jì)漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.2.2 不同接種時(shí)間對(duì)胚發(fā)育的影響

取玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的雜交胚珠在胚珠發(fā)育培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d后進(jìn)行剝胚處理，調(diào)查胚發(fā)育的情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)幼胚萌發(fā)率的影響

分別取授粉后45d和55d玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰雜交胚珠在發(fā)育培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d后，分別進(jìn)行剝胚和剪喙處理，轉(zhuǎn)入胚萌發(fā)培養(yǎng)基，并統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)率、成苗率以及畸形苗率。

胚珠培養(yǎng)采用的ER培養(yǎng)基（0.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，pH5.8，5g/L瓊脂）。胚萌發(fā)過(guò)程中采用剝胚和剪喙兩種處理方法，在WPM培養(yǎng)基（0.2mg/L6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，5g/L瓊脂，pH5.8）上培養(yǎng)，30d后調(diào)查胚成苗情況。

分別統(tǒng)計(jì)接種胚珠數(shù)、胚發(fā)育率、胚萌發(fā)率、胚成苗率和畸形苗率，計(jì)算方法如下：

胚發(fā)育率=（發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100%；胚萌發(fā)率=（萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100%；成苗率為=（正常苗數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)）×100%；畸形苗率（畸形苗數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交果實(shí)胚珠重量、胚珠數(shù)量變化觀察

由表1可以看出：在授粉后35～55d，隨著取樣時(shí)間延遲，玫瑰香×戶太8號(hào)雜交果實(shí)平均重量持續(xù)增加，而雜交胚珠平均重量則呈先減后增趨勢(shì)，單粒漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)逐漸減少。玫瑰香×巨峰雜交果實(shí)平均重量先增后減，雜交胚珠重則呈先減后增趨勢(shì)，單粒漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)逐漸減少。

表1 不同接種時(shí)期果實(shí)重、胚珠重及胚珠數(shù)的觀察

2.2 不同接種時(shí)間對(duì)胚發(fā)育的影響

由表2可以看出：隨取樣時(shí)間的延遲，玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰胚珠內(nèi)胚發(fā)育率總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在授粉后55d胚發(fā)育率均達(dá)到最高；在授粉后45～55d，兩個(gè)雜交組合胚珠內(nèi)胚發(fā)育率呈明顯上升趨勢(shì)。在相同的采樣時(shí)間，玫瑰香×戶太8號(hào)胚發(fā)育率均高于玫瑰香×巨峰，不同的父本基因型對(duì)胚發(fā)育率也有一定的影響。

表2 不同取樣時(shí)期對(duì)胚發(fā)育率的影響

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)幼胚萌發(fā)率的影響

由表3可以看出：不同取樣時(shí)間，玫瑰香×戶太8號(hào)胚珠內(nèi)胚萌發(fā)率剝胚處理高于剪喙處理，而玫瑰香×巨峰胚珠內(nèi)胚萌發(fā)率剝胚處理低于剪喙處理；兩個(gè)雜交組合的成苗率剪喙處理均高于剝胚處理，畸形苗率則是剝胚處理均高于剪喙處理；隨著取樣時(shí)期推遲，兩個(gè)雜交組合的剝胚處理胚萌發(fā)率、成苗率均上升，畸形苗率下降；玫瑰香×戶太8號(hào)剪喙處理胚萌發(fā)率、成苗率先升高后降低，玫瑰香×巨峰胚萌發(fā)率升高，成苗率則先升高后降低；在胚挽救過(guò)程中，兩個(gè)雜交組合，采取剪喙處理雜交胚更容易獲得正常苗，因此剪喙為較好的處理方式；玫瑰香×戶太8號(hào)和玫瑰香×巨峰在授粉后45d經(jīng)剪喙處理更容易獲得正常苗，因此授粉后45d為較好的取樣時(shí)期。

表3 不同處理方法對(duì)胚萌發(fā)胚成苗的影響

3 討論與結(jié)論

確定胚珠接種的最佳時(shí)間是胚挽救成功的前提。關(guān)于葡萄二倍體與四倍體的取樣時(shí)間，Yamashita等[2-3]和Okamoto等[4]報(bào)道的時(shí)間基本集中在授粉后50～70d。徐海英等[5]研究表明葡萄二倍體與四倍體雜交胚發(fā)育進(jìn)程與無(wú)核品種有顯著不同，同一品種內(nèi)存在果粒大小不整齊及同一果實(shí)中胚珠發(fā)育程度不一致現(xiàn)象，根據(jù)胚珠重量繪出的胚珠生長(zhǎng)曲線有些表現(xiàn)呈無(wú)規(guī)則，葡萄二倍體與四倍體雜交胚珠敗育是漸進(jìn)性的，發(fā)生敗育的時(shí)間與母本成熟期有明顯的關(guān)系，不同倍性的有核品種間雜交胚珠的敗育存在明顯的個(gè)體間差異。本研究中兩個(gè)雜交組合果實(shí)重和胚珠重表現(xiàn)有些無(wú)規(guī)則，而從胚珠數(shù)呈持續(xù)降低趨勢(shì)可以看出，在授粉后35d起，兩組雜交組合胚珠敗育逐漸增強(qiáng)。

葡萄的外種皮對(duì)于發(fā)育不完全胚存在著機(jī)械阻礙[6]，影響胚的萌發(fā)。眾多研究學(xué)者認(rèn)為，對(duì)葡萄珠被進(jìn)行一定的處理，可以提高無(wú)核葡萄胚的萌發(fā)及成苗率。Fernandez[7]對(duì)無(wú)核與無(wú)核雜交胚珠分別采用了3種珠被處理方式，直接進(jìn)行胚珠培養(yǎng)獲得幼苗，對(duì)于胚珠進(jìn)行切喙處理，剝?nèi)÷闩哌M(jìn)行胚萌發(fā)培養(yǎng)。結(jié)果顯示：剝?nèi)÷闩呙劝l(fā)率顯著高于其他兩種處理，最高可達(dá)67%。而經(jīng)過(guò)切喙和胚珠直接培養(yǎng)胚萌發(fā)率僅為0～15%，E－mershad[8]、Ramming[9]、Spigel-Rol[10]、Cain[11]等采用胚珠培養(yǎng)再剝?nèi)÷闩吲囵B(yǎng)來(lái)提高無(wú)核葡萄的胚挽救成功率。郭印山等[12]對(duì)二倍體與四倍體葡萄雜種胚珠采取橫切的方法獲得了三倍體植株，郭海江、王躍進(jìn)等[13]采取剝?nèi)÷闩叩姆椒ǐ@得了大量的雜種后代。孟新法等[14]研究發(fā)現(xiàn)剝?nèi)÷闩撸梢允古呙劝l(fā)提前，萌發(fā)整齊，提高成苗質(zhì)量，并且能直接判斷最后的成苗是合子胚還是體細(xì)胞胚。蔣愛麗等[15]研究認(rèn)為：盡管采取剝胚得到的有胚率為最高，但是由于操作中易碰傷及其他原因，畸形苗占相當(dāng)比例，所得正常的試管苗比不剝胚的還略低些。

本研究以玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰雜交胚珠為試材，研究發(fā)現(xiàn)兩組雜交組合授粉后35d起，胚珠敗育逐漸增強(qiáng)，在授粉后55d取樣，胚發(fā)育率最高；經(jīng)剪喙處理過(guò)的雜交胚珠成苗率高且畸形苗率低。在胚挽救過(guò)程中，兩個(gè)雜交組合，采取剪喙處理雜交胚更容易獲得正常苗，因此剪喙為較好的處理方式；玫瑰香×戶太8號(hào)和玫瑰香×巨峰，在授粉后45d經(jīng)剪喙處理更容易獲得正常苗，因此授粉后45d為較好的取樣時(shí)期。

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