半纖維素?zé)晒馓结樀臉?gòu)建與應(yīng)用

裴海生，鄭宏臣，王民敬，陳　洲，孫君社*（.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，北京 005；.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

半纖維素?zé)晒馓结樀臉?gòu)建與應(yīng)用

裴海生1，鄭宏臣2，王民敬1，陳洲1，孫君社1*
（1.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，北京 100125；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

該研究將綠色熒光蛋白（GFP）同木聚糖酶底物結(jié)合域（XBD）結(jié)合，構(gòu)建了能夠特異性結(jié)合半纖維素的熒光探針，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡比較分析GFP和GFP-XBD熒光融合蛋白對(duì)玉米秸稈的結(jié)合差異，發(fā)現(xiàn)GFP-XBD熒光融合蛋白溶液處理玉米秸稈半纖維素所在區(qū)域熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他樣品，表明所構(gòu)建的半纖維素?zé)晒馓结樋梢耘c細(xì)胞壁中半纖維素特異性結(jié)合。熒光測(cè)定結(jié)果顯示，GFP和GFP-XBD的蛋白含量與熒光強(qiáng)度之間有著良好的線性關(guān)系（R12=0.994 4，R22=0.995 1），成功地表征了玉米秸稈預(yù)處理過(guò)程中半纖維素的變化規(guī)律，最終確定最佳的預(yù)處理溫度為130℃。

半纖維素；綠色熒光蛋白；木聚糖酶底物結(jié)構(gòu)域；熒光探針

木質(zhì)纖維素主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組分所構(gòu)成的超分子功能結(jié)構(gòu)的聚集體［1］。在長(zhǎng)期的自然演變過(guò)程中，木質(zhì)纖維素進(jìn)化出復(fù)雜的化學(xué)組分及超微分子結(jié)構(gòu)，形成了應(yīng)對(duì)微生物和酶攻擊降解的天然屏障［2］，使得目前單獨(dú)利用生物法轉(zhuǎn)化的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化需求［3］。木質(zhì)纖維素的這種抗降解屏障特性［4-5］要求必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，才能夠?qū)崿F(xiàn)生物煉制的第一步——組分分離。半纖維素是木質(zhì)纖維素中的第二大組分，約占20%～35%，是預(yù)處理的主要研究對(duì)象之一，其轉(zhuǎn)化利用主要發(fā)生在預(yù)處理階段。半纖維素本身可作為膽固醇抑制劑和藥片分解劑，其水解可制備功能性低聚糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，得到的糖可進(jìn)一步生產(chǎn)木糖醇、乙醇、丁醇、有機(jī)酸、糠醛等液體生物燃料或大宗化工產(chǎn)品［6］。半纖維素用來(lái)生產(chǎn)高附加值的工業(yè)產(chǎn)品更有前景，充分利用纖維素和半纖維素組分并使其產(chǎn)品價(jià)值最大化，可以降低醇類(lèi)液體燃料的生產(chǎn)成本，提高木質(zhì)纖維素綜合生物煉制的經(jīng)濟(jì)效益［7］?？紤]到半纖維素固有的復(fù)雜性、類(lèi)型的多樣性以及各種化學(xué)預(yù)處理所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的多樣性，利用木聚糖酶將半纖維素定向降解為木糖或低聚木糖產(chǎn)物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)［8-12］。木聚糖酶具有一個(gè)普遍的特征：酶分子是由一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的，每個(gè)酶分子常常包含催化模塊和碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate binding modu1e，CBM）。CBM在纖維素類(lèi)降解酶系中普遍存在，其作用是與纖維素或半纖維素表面結(jié)合，將催化結(jié)構(gòu)域拉近到不溶性的纖維素或半纖維素表面，使這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域能特異的結(jié)合相應(yīng)的不溶性底物并對(duì)酶的穩(wěn)定性有所影響，使水解過(guò)程易于進(jìn)行［13］。

為了考察預(yù)處理過(guò)程生物質(zhì)原料微觀結(jié)構(gòu)的變化情況及半纖維素在預(yù)處理過(guò)程中的溶出規(guī)律，本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了能夠特異性結(jié)合半纖維素的探針，該探針是由綠色熒光蛋白（green f1uorescent protein，GFP）和木聚糖底物結(jié)合域CBM6_36_xy1anase-1ike（xy1ansubstrate domain，XBD）構(gòu)成的融合蛋白，并進(jìn)一步驗(yàn)證了探針同玉米秸稈原料中半纖維素結(jié)合的特異性。確立了一種表征木質(zhì)纖維素中半纖維素降解機(jī)制的物理檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法初步探索了不同溫度稀酸預(yù)處理對(duì)玉米秸稈中半纖維素降解的規(guī)律。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

玉米秸稈（紀(jì)元一號(hào)）：采收于河北省衡水市，采收后的秸稈原料進(jìn)行干燥、粉碎，過(guò)40目篩后，貯存在塑料袋中，-20℃保藏。經(jīng)成分分析，其組成為：纖維素35.23%，木聚糖17.33%，阿拉伯聚糖4.16%，半乳聚糖3.26%，木質(zhì)素18.90%，灰分6.90%，蛋白質(zhì)5.44%，其他8.78%。

1.1.2菌株及質(zhì)粒

本研究所用菌株及質(zhì)粒如表1所示。

表1　試驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the experiments

1.1.3主要試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonuc1eic acid，DNA）聚合酶（2.5 U/μL）、限制性?xún)?nèi)切酶（10 U/μL）：美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、普通聚合酶鏈反應(yīng)（po1ymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒：美國(guó)Omega生物技術(shù)公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DYY-III電泳槽：北京六一儀器廠；GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像儀：美國(guó)SYNGENE公司；PTC-200型PCR基因擴(kuò)增儀：美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司；LEXT OLS4100激光掃描共聚焦顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；Infinite F50多功能酶標(biāo)儀：瑞士帝肯（Tecan）貿(mào)易有限公司。

1.3方法

1.3.1熒光融合蛋白編碼基因的構(gòu)建

以木聚糖酶XynG1-1的編碼基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物XBD P1和XBD P2（見(jiàn)表2）擴(kuò)增該基因中編碼木聚糖底物結(jié)合域CBM6_36_xy1anase-1ike（XBD）的編碼基因。

重疊PCR需要設(shè)計(jì)4條引物（見(jiàn)表2），其中P1和P4分別為GFP編碼基因的N端上游引物和XBD的C段下游引物，用于擴(kuò)增重組基因全長(zhǎng)的上下游引物，引物兩端要添加與載體連接所用的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，P2和P3是兩條同時(shí)含有兩個(gè)基因相連接的部分基因片段的反向互補(bǔ)引物；PCR擴(kuò)增分兩輪進(jìn)行，第一輪以攜帶目的基因的質(zhì)粒為模板（適當(dāng)稀釋?zhuān)?，并分別以P1、P2和P3、P4為引物，應(yīng)用Pyrobest高保真DNA聚合酶分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最終得到重組的熒光融合蛋白編碼基因，進(jìn)行下一步操作。

表2　分子克隆所用模板、引物及擴(kuò)增方法Table 2 Template，primers and PCR method for molecular cloning

1.3.2重組熒光融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

應(yīng)用EcoRI和HindIII同步雙酶切PCR產(chǎn)物及載體DNA（pET22b）。酶切后的DNA產(chǎn)物及載體DNA使用膠回收試劑盒回收。載體DNA與PCR產(chǎn)物按物質(zhì)的量比1∶1～1∶10混合，再加入等體積的DNA連接試劑盒中的So1ution I，在16℃恒溫連接2～4 h。隨后通過(guò)電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入E.co1iDH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100μL培養(yǎng)液涂布到氨芐青霉素（Ampici11in，Amp）抗性平板上，37℃倒置培養(yǎng)16～20 h；在平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌體PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的陽(yáng)性重組子活化后，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy1-β-D-thioga1actoside，IPTG）（終濃度為1mmo1/L）誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵，20℃、100 r/min誘導(dǎo)16 h。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，所得細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎后，4℃、12 000 r/min離心10min取上清液，得到重組熒光融合蛋白粗溶液，再對(duì)該粗溶液應(yīng)用鎳離子親和層析進(jìn)行一步純化［14］。

1.3.3GFP-XBD探針對(duì)半纖維素特異性吸附試驗(yàn)

選擇自然風(fēng)干的玉米秸稈，制成約為25 μm厚的切片。將切片浸泡在含有100 μg/mL GFP或GFP-XBD蛋白的溶液中約10 min。然后取出切片，置于盛有去離子水的容器中，反復(fù)洗滌3次，洗去沒(méi)有結(jié)合在半纖維素上的GFP或GFP-XBD蛋白。最后將洗滌過(guò)的切片做成玻片標(biāo)本，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡設(shè)置為：Ar/ArKr激光器激發(fā)波長(zhǎng)488nm，檢測(cè)發(fā)射光波長(zhǎng)為492～632 nm，激發(fā)值80%，偽彩色使用綠色，通過(guò)單次掃描方式進(jìn)行圖像采集，圖像使用EZ-C1 3.0 FreeViewer分析處理。

1.3.4預(yù)處理溫度的選擇

在預(yù)處理溫度分別為100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃和160℃條件下對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，用硫酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，預(yù)處理時(shí)間為20 min，料液比為1∶35 （g∶mL），獲得預(yù)處理液。

將玉米秸稈預(yù)處理液進(jìn)行抽濾，用去離子水將殘?jiān)磧簦缓髮⑹Ｓ嗟挠衩捉斩挶圃M(jìn)行烘干，粉碎過(guò)40目，備用。分別制備純化后的GFP、GFP-XBD熒光蛋白溶液，并稀釋到一定的質(zhì)量濃度。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀分別測(cè)定GFP、GFP-XBD熒光蛋白的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)［15］。在對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)（490 nm）和發(fā)射波長(zhǎng)（525 nm）條件下測(cè)定2種稀釋后的熒光蛋白溶液的熒光強(qiáng)度，即為初始熒光強(qiáng)度，將待測(cè)玉米秸稈樣品與GFP及GFP-XBD溶液以1∶50（g∶mL）的比例在室溫下作用2 h，離心后測(cè)上清液的剩余熒光強(qiáng)度。

吸附率是指熒光蛋白非特異性吸附到細(xì)胞壁上的部分，其計(jì)算公式如下：

吸附結(jié)合率是指熒光蛋白特意性吸附以及非特異性吸附到細(xì)胞壁上的總比率，其計(jì)算公式如下：

結(jié)合率是吸附結(jié)合率與吸附率之差，反映了熒光探針對(duì)秸稈半纖維素特異性結(jié)合的強(qiáng)度，其計(jì)算公式如下：

結(jié)合率=吸附結(jié)合率-吸附率

1.3.5玉米秸稈預(yù)處理過(guò)程中纖維素、半纖維素含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的玉米秸稈殘?jiān)?.3 g放入15 mL試管中，加入3.0 mL 72%的硫酸溶液，漩渦混合，將試管放入30℃水浴鍋中保持60 min，期間每隔5～10 min漩渦混合一次，反應(yīng)結(jié)束后，準(zhǔn)確加入去離子水84 mL，放入高壓滅菌鍋中121℃保持1 h，高效液相色譜（high performance 1iquid chromatography，HPLC）法測(cè)定水解液的葡萄糖和木糖含量，用于計(jì)算樣品中纖維素和半纖維素的含量。樣品中纖維素和半纖維素含量的計(jì)算公式如下：

式中：C1為反應(yīng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為反應(yīng)液中木糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V是反應(yīng)體系總體積，即87 mL；0.9是葡萄糖轉(zhuǎn)化為纖維素的系數(shù)；0.88是木糖轉(zhuǎn)化為半纖維素的系數(shù)；m是待測(cè)樣品干物質(zhì)質(zhì)量，mg。

纖維素和半纖維素去除率計(jì)算公式如下：

纖維素去除率=

2　結(jié)果與分析

2.1GFP-XBD探針的構(gòu)建

通過(guò)重疊PCR獲得重組的熒光融合蛋白編碼基因GFP-XBD、GFP和XBD3個(gè)基因片段的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖如圖1所示。由圖1可知，GFP基因全長(zhǎng)717 bp，XBD基因全長(zhǎng)357 bp，構(gòu)建的GFP-XBD基因全長(zhǎng)為1 074 bp，共編碼358個(gè)氨基酸，說(shuō)明重疊PCR最終得到了重組基因GFP-XBD。隨后構(gòu)建分別含有GFP-XBD和GFP基因的表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入E.co1iBL21進(jìn)行表達(dá)。圖2為GFP-XBD蛋白、GFP蛋白及空白對(duì)照在激發(fā)光（488 nm）照射下熒光表達(dá)情況，由圖2可知，GFP-XBD蛋白、GFP蛋白均能發(fā)出明顯的綠色熒光，表明經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白具有較高的熒光活性。

圖1　PCR產(chǎn)物分析Fig.1 PCR products analysis

圖2　熒光融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的熒光效果Fig.2 Fluorescent effect of expression product by fluorescent fusion protein inducing

2.2GFP-XBD探針對(duì)生物質(zhì)中半纖維素標(biāo)定的特異性

對(duì)未經(jīng)任何處理的玉米秸稈自發(fā)熒光、使用含GFP熒光蛋白溶液處理后玉米秸稈的熒光分布、使用含GFP-XBD熒光融合蛋白溶液處理后玉米秸稈的熒光分布進(jìn)行研究。為了后續(xù)比較，這三組采用的激發(fā)值均為80%。結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同玉米秸稈樣品細(xì)胞壁的熒光分布及熒光強(qiáng)度Fig.3 The distribution and intensity of fluorescence of cell wall in different corn stover samples

圖3A為玉米秸稈在激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm時(shí)的自發(fā)熒光分布結(jié)果，圖3B是圖3A中橫線部分所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。已有研究表明［14］，在該激發(fā)波長(zhǎng)下的自發(fā)熒光主要來(lái)自于植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素。明亮區(qū)域代表高熒光強(qiáng)度，表示木質(zhì)素含量高，由圖3A可知，維管束鞘、后生木質(zhì)部這些部位的厚壁細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量要高于維管束鞘之間的薄壁細(xì)胞壁中的木質(zhì)素含量。由圖3B可知，在該激發(fā)值下，細(xì)胞壁的自發(fā)熒光強(qiáng)度大都在1 000 AU左右。

圖3C為含有GFP蛋白探針溶液處理后細(xì)胞壁的熒光分布，圖3D為圖3C中橫線部分所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。由3C與圖3A相比較可知，熒光分布十分相似，差別在于圖3C的亮度整體比圖3A高一些，圖3D中細(xì)胞壁熒光強(qiáng)度在1 500 AU左右。因此，圖3C中細(xì)胞壁的熒光一部分來(lái)自于細(xì)胞壁中木質(zhì)素的自發(fā)熒光，另一部分是來(lái)自于細(xì)胞壁對(duì)GFP熒光蛋白的非特異性吸附。

圖3E是含有GFP-XBD熒光融合蛋白探針溶液處理后細(xì)胞壁的熒光分布，圖3F為圖3E中橫線部分所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。該圖中細(xì)胞壁的熒光強(qiáng)度明顯高于圖3B和圖3C的熒光強(qiáng)度，由此可知其熒光強(qiáng)度主要來(lái)自于3部分：最主要的部分來(lái)自于細(xì)胞壁中半纖維素對(duì)GFP-XBD熒光蛋白的特異性結(jié)合，另一小部分來(lái)自于細(xì)胞壁中木質(zhì)素的自發(fā)熒光（圖3B），最后一部分是來(lái)自于細(xì)胞壁對(duì)GFP-XBD熒光蛋白的非特異性吸附（圖3D）。由圖3E可知，細(xì)胞壁對(duì)熒光蛋白的吸附是均勻的，而植物細(xì)胞壁自發(fā)熒光較弱，因此，暫且使用圖3E熒光分布情況來(lái)估測(cè)植物細(xì)胞壁中的半纖維素分布情況。由圖3F可知，細(xì)胞壁熒光強(qiáng)度分布十分不均，從2 000～4 000 AU均有分布。維管束之間的薄壁細(xì)胞、維管束中原生木質(zhì)部區(qū)域細(xì)胞壁的熒光強(qiáng)度很高，在4 000 AU左右；而位于維管束鞘中的厚壁細(xì)胞壁的熒光強(qiáng)度很弱，僅在1 500 AU左右。亮度高代表高熒光強(qiáng)度，表示可以與探針結(jié)合的半纖維素含量高。由此推測(cè)：維管束之間的薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁及原生木質(zhì)部中可以與探針結(jié)合的半纖維素含量高。但維管束鞘中可以與探針結(jié)合的半纖維素很少，可能是因?yàn)樵摬糠旨?xì)胞壁中木質(zhì)素含量較高，不利于半纖維素探針的結(jié)合，即木質(zhì)素的存在會(huì)影響半纖維素與熒光探針的結(jié)合。由以上分析可知，構(gòu)建的半纖維素探針是可以與細(xì)胞壁中半纖維素特異性結(jié)合的。

2.3GFP和GFP-XBD蛋白含量與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

以GFP和GFP-XBD蛋白濃度（x）為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)，繪制GFP和GFP-XBD蛋白含量與熒光強(qiáng)度之間關(guān)系曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　GFP（A）和GFP-XBD（B）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of GFP（A）and GFP-XBD（B）

由圖4可知，GFP和GFP-XBD的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別為：y=34920x+1681.5，R12=0.9944、y=23 783x+ 1 021.1，R22=0.995 1；結(jié)果表明，GFP和GFP-XBD的蛋白含量與熒光強(qiáng)度之間有著良好的線性關(guān)系，這樣可以通過(guò)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度來(lái)反映樣品蛋白含量，避免了蛋白分離提取環(huán)節(jié)，應(yīng)用起來(lái)會(huì)更加方便可行。

2.4不同預(yù)處理溫度對(duì)熒光融合蛋白結(jié)合底物的影響

稀酸高溫預(yù)處理能夠破壞玉米秸稈固有結(jié)構(gòu)，提高后期酶解效率，但是溫度過(guò)高會(huì)造成單糖損失，過(guò)低則無(wú)法破壞初始結(jié)構(gòu)，因此選擇在100～160℃下稀酸處理玉米秸稈，隨后考察了GFP-XBD結(jié)合纖維素及半纖維素的去除率變化情況，結(jié)果分別見(jiàn)圖5、圖6。

圖5　不同預(yù)處理溫度對(duì)GFP-XBD結(jié)合半纖維素的影響Fig.5 Effect of different pretreatment temperature on GFP-XBD combining with hemicellulose

圖6　不同預(yù)處理溫度對(duì)半纖維素、纖維素去除率的影響Fig.6 Effect of different pretreatment temperature on removal rate of hemicellulose and cellulose

由圖5可知，隨著預(yù)處理溫度的提高，玉米秸稈底物對(duì)熒光蛋白的吸附率逐漸升高，這是由于預(yù)處理溫度越高，玉米秸稈的結(jié)構(gòu)越松散，半纖維素溶出增加，增大了玉米秸稈的表面積；而在100～130℃，玉米秸稈結(jié)合木聚糖酶底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（GFP-XBD）的能力隨溫度升高而升高，在130℃達(dá)到最大值，為90%。當(dāng)預(yù)處理溫度＞130℃時(shí)，玉米秸稈結(jié)合木聚糖酶底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合率逐漸下降，由圖6可知，這是由于預(yù)處理溫度＞130℃后，半纖維素去除率開(kāi)始迅速增加，玉米秸稈半纖維素大部分溶出，固體半纖維素減少，從而導(dǎo)致GFP-XBD結(jié)合率降低。綜合分析，預(yù)處理溫度為130℃時(shí)，玉米秸稈半纖維素和纖維素溶出較少，但結(jié)構(gòu)已經(jīng)松散，半纖維素結(jié)合GFP-XBD的結(jié)合率可達(dá)80%，說(shuō)明此時(shí)應(yīng)用木聚糖酶酶解半纖維素將會(huì)達(dá)到較高降解率，并且預(yù)處理溫度不高，可節(jié)約能耗，因此，選擇預(yù)處理溫度為130℃。

3　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了融合熒光蛋白GFP-XBD的大腸桿菌表達(dá)體系，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡比較分析GFP熒光蛋白和GFP-XBD熒光融合蛋白對(duì)玉米秸稈的結(jié)合差異，發(fā)現(xiàn)GFP-XBD熒光融合蛋白溶液處理秸稈半纖維素所在區(qū)域熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他樣品，表明所構(gòu)建的半纖維素探針可以與細(xì)胞壁中半纖維素特異性結(jié)合。熒光測(cè)定結(jié)果顯示，GFP和GFP-XBD的蛋白含量與熒光強(qiáng)度之間有著良好的線性關(guān)系，成功地表征了玉米秸稈預(yù)處理過(guò)程中半纖維素的變化規(guī)律，最終確定最佳的預(yù)處理溫度為130℃。由此可見(jiàn)，利用熒光探針?lè)椒梢员碚髂举|(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程中半纖維素降解規(guī)律，進(jìn)而選擇最佳的預(yù)處理工藝及條件，可為生物質(zhì)資源的高效利用開(kāi)辟一條新的途徑。

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Construction and app1ication of hemice11u1ose f1uorescent probe

PEI Haisheng1，ZHENG Hongchen2，WANG Minjing1，CHEN Zhou1，SUN Junshe1*
（1.Chinese Academy of Agricu1tura1 Engineering，Beijing 100125，China；2.Tianjin Institute of Industria1 Biotechno1ogy，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

The f1uorescence probe which cou1d specifica11y bind to hemice11u1ose was constructed with combination of green f1uorescent protein（GFP）and xy1anase substrate domain（XBD）.The differences of GFP and GFP-XBD on combining corn stover were compared and ana1yzed by confoca1 1aser scanning microscope.The f1uorescence signa1 intensity of corn stover hemice11u1ose by GFP-XBD so1ution was significant1y higher than other samp1es.The resu1ts indicated that the hemice11u1ose f1uorescent probe cou1d specifica11y bind to hemice11u1ose of ce11 wa11.The resu1ts of f1uorometric ana1ysis showed that protein content of GFP and GFP-XBD had a good 1inear re1ationship with f1uorescence intensity（R12=0.994 4，R22=0.995 1）. The change pattern hemice11u1ose was described successfu11y during corn stover pretreatment process.At 1ast，the optimum pretreatment temperature was determined as 130℃.

hemice11u1ose；green f1uorescent protein；xy1anase substrate domain；f1uorescent probe

Q939.97

A

0254-5071（2015）12-0132-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.029

2015-09-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（21176247）

裴海生（1981-），男，工程師，博士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源綜合利用。

孫君社（1961-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與酶工程。