響應(yīng)面法優(yōu)化火棘果中多酚提取工藝

吳　偉，李　格，向　福*（1.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000；.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；3.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000）

響應(yīng)面法優(yōu)化火棘果中多酚提取工藝

吳偉1，2，李格2，向福1，3*
（1.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000；2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；3.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000）

以火棘果為原料，乙醇溶液為溶劑提取其中的多酚類化合物。通過對火棘果多酚提取的單因素試驗，并根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，得出火棘果中多酚的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，料液比1∶20（g∶mL），提取時間4.0 h，提取次數(shù)3次。在此條件下進(jìn)行3次驗證試驗，得出火棘果多酚提取率的平均值為2.84%，與回歸方程得出的理論數(shù)值2.85%基本相符。該研究為大別山區(qū)火棘果資源的綜合利用提供了理論依據(jù)。

火棘果；多酚；提??；響應(yīng)面分析法

火棘（Pyracantha fortuneana）是薔薇科常綠野生灌木或小喬木植物，共有10種，廣泛分布于亞洲東部至歐洲南部。我國已發(fā)現(xiàn)7種，常見的為火棘、窄葉火棘、細(xì)圓齒火棘、全緣火棘4種，其中分布最廣、產(chǎn)量最大的為火棘，又叫救軍糧、火把果、赤陽子等，主要分布于中國黃河以南及西南地區(qū)，包括陜西、浙江、廣西、云南、貴州、四川、湖北等省份［1］，其中貴州的鮮果年產(chǎn)量達(dá)到2 500萬公斤以上，而湖北甚至年產(chǎn)量達(dá)到1億公斤［2-3］。大別山區(qū)火棘果資源非常豐富，如何更好的綜合利用火棘果資源，提高產(chǎn)品附加值，將對該地區(qū)的其他特色資源的開發(fā)利用提供參考與借鑒。

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物，具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)并結(jié)合有一個或多個羥基［4-5］。它是植物的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于植物的皮、根、莖、葉和果實中，在自然界中的資源十分豐富。狹義的看，可以認(rèn)為植物多酚指的是鞣質(zhì)或單寧，其分子質(zhì)量為500～3 000 u；廣義的看，它還包括了小分子酚類化合物，如各種黃酮類化合物［6］、沒食子酸、兒茶素、花青素、鞣花酸和熊果苷等天然酚類［7-8］。近年來，隨著多酚類物質(zhì)抗病原微生物、抗腫瘤、延緩機體衰老、以及抗氧化等生物活性功能的發(fā)現(xiàn)，使其在食品、醫(yī)藥、化妝品、日用化學(xué)品及保健品等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。但對火棘果的研究主要集中在營養(yǎng)成分，功效方面，對其有效成分如多酚的有效提取少有報道。本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗對火棘果多酚提取工藝進(jìn)行探討，為充分利用大別山區(qū)的火棘果資源提供便利。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

火棘果：采自湖北省羅田縣。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：上海金穗生物科技有限公司；鎢酸鈉、鉬酸鈉（均為分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；硫酸鋰、結(jié)晶碳酸鈉、石油醚（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：武漢市洪山中南化工試劑有限公司；濃磷酸（分析純）：深圳市琪運達(dá)化工有限公司；濃鹽酸（分析純）：中平能化集團(tuán)開封東大化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SF-130C萬能粉碎機：吉首市中誠制藥機械廠；752SP型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HWS26水浴鍋：上海一恒科技有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海姚氏儀器設(shè)備廠。

1.3試驗方法

1.3.1火棘果的預(yù)處理

將火棘果用清水漂洗，除去泥沙、塵土等雜質(zhì)，在60℃條件下進(jìn)行烘干處理。然后將干燥的火棘果粉碎。最后將火棘果粉末用石油醚在60℃條件下回流1 h，再干燥備用。

1.3.2Fo1in-Cioca1teau試劑的配制

稱取80 g的鎢酸鈉和20 g的鉬酸鈉置于圓底燒瓶中，用560 mL的去離子水溶解后，加入85%的磷酸溶液40 mL 和80 mL的濃鹽酸，用文火回流10 h，然后加入12 g的Li2SO4及60 mL的H2O2，加熱沸騰15 min至試劑呈亮黃色，不得帶微藍(lán)和綠色，冷卻后，移入1 000 mL的容量瓶中，定容，貯于棕色瓶中［9-10］。

1.3.3沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在減壓干燥箱中，將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品減壓干燥至質(zhì)量恒定，于萬分之一分析天平精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用去離子水溶解并定容到250mL的容量瓶中，得0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密吸取母液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于50 mL容量瓶中，加入5 mLFo1in-Cioca1teu試劑，搖勻后再加入10mL20%Na2CO3溶液，用去離子水定容至50mL，即得0、0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對照溶液。室溫下反應(yīng)2 h后，測定其在波長760 nm處的吸光度值，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得回歸方程A=171.06C+0.012 5，R2= 0.9962，表明質(zhì)量濃度為0～0.005mg/mL時線性關(guān)系良好。

1.3.4火棘果多酚的提取

準(zhǔn)確稱取火棘果粉末1 g于圓底燒瓶中，以一定的料液比，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定溫度下，回流提取一定的時間和次數(shù)，然后抽濾得濾液，濃縮，定容于100mL的容量瓶中為樣品溶液。精密吸取樣品溶液2.5mL于25mL的容量瓶中，加入2.5 mL Fo1in-Cioca1teu試劑，搖勻后再加入5mL20%Na2CO3溶液，用去離子水定容至25mL，室溫下反應(yīng)2 h后，測定其在波長760 nm處的吸光度值，得到火棘果多酚質(zhì)量濃度，并計算多酚提取率，其計算公式如下：

1.3.5單因素試驗

提取方法見1.3.4，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（65%、70%、75%、80%、85%、90%）、提取溫度（60℃、65℃、70℃、75℃、80℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）（g∶mL）、提取時間（2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h）和提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對火棘果多酚提取率的影響。

1.3.6響應(yīng)面分析試驗

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理［11］，綜合考慮單因素試驗的結(jié)果，以多酚提取率（Y）為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，設(shè)計響應(yīng)面試驗，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1響應(yīng)面設(shè)計因素和水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.3.7驗證試驗

為了驗證響應(yīng)面分析法得到的模型和回歸方程的準(zhǔn)確性。根據(jù)響應(yīng)面分析法得到的最優(yōu)條件以及考慮實際操作的便利性后確定最終條件，在最佳條件下進(jìn)行3次平行試驗。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on polyphenol extraction efficiency

在提取溫度70℃，提取時間4.0 h，料液比1∶20（g∶mL），提取次數(shù)3次的條件下探索不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響，其結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從65%上升到70%時，多酚的提取率增大，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞70%時提取率減小。其原因可能是高濃度乙醇使醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量增加［12］，導(dǎo)致干擾因素的增加，使純化過程更加困難。因此，體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇最合適。

2.1.2提取溫度對多酚提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間4.0 h，料液比1∶20 （g∶mL），提取次數(shù)3次的條件下探索不同提取溫度對多酚提取率的影響關(guān)系，其結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)溫度為60～70℃時，多酚的提取率穩(wěn)步上升；溫度70℃時提取率達(dá)到峰值；70～80℃時提取率開始下降。這種現(xiàn)象可能原因為隨著溫度升高，溶劑黏度下降且分子運動加速，這導(dǎo)致多酚的擴(kuò)散系數(shù)增大，使其溶解度增加。但是，高溫能促進(jìn)多酚的氧化轉(zhuǎn)化，使其提取率下降。因此，提取溫度70℃最合適。

圖2　提取溫度對多酚提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polyphenol extraction efficiency

2.1.3提取時間對多酚提取率的影響

圖3　提取時間對多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polyphenol extraction efficiency

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，料液比1∶20 （g∶mL），提取次數(shù)3次的條件下探索不同提取時間對多酚提取率的影響，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)提取時間為2.5～3.5 h時，提取率的變化相對平穩(wěn)；在3.5～4.0 h時，穩(wěn)步上升；在4.0 h時達(dá)到峰值；當(dāng)提取時間超過4.0 h，提取率急劇下降。其原因可能是在一定的范圍內(nèi)，提取時間越長，乙醇與火棘果粉末相互作用的時間越長，因而提取率增加，但當(dāng)兩者達(dá)到平衡后，若再延長提取時間其他雜質(zhì)也會被提取出來，使多酚相對含量減少［13］。因此，提取時間為4.0 h最合適。

2.1.4提取料液比對多酚提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時間4.0 h，提取次數(shù)3次的條件下探索不同料液比對多酚提取率的影響，其結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，多酚的提取率隨提取液使用量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當(dāng)提取料液比為1∶20（g∶mL）時，提取率達(dá)到最大。其可能原因是由于浸提液較多，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間較長，造成多酚類化合物損失一部分［14］。同時，料液比過大也會造成乙醇溶劑和能源的浪費。因此，本試驗中料液比為1∶20（g∶mL）最合適。2.1.5提取次數(shù)比對多酚提取率的影響

圖4　料液比對多酚提取率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on polyphenol extraction efficiency

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時間4.0 h，料液比1∶20（g∶mL）的條件下探索不同提取次數(shù)對多酚提取率的影響，其結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，多酚的提取率隨提取次數(shù)的增長呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢。當(dāng)提取次數(shù)高于3次時，提取率增加不明顯，從提取效果和降低成本等方面綜合考慮，提取3次比較合適。

圖5　提取次數(shù)對多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on polyphenol extraction efficiency

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert V8.0.6.1中Box-Behnken模型，按照表1中的因素水平進(jìn)行試驗。以X1（提取溫度）、X2（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、X3（料液比）為自變量，以火棘果多酚提取率為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2響應(yīng)面試驗分析結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

由于各因素對多酚提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，為了更明確各因素對響應(yīng)值的影響，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件，對表3中火棘果多酚提取率試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚提取率（Y）對提取溫度（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、料液比（X3）的回歸方程為：

模型的可靠性可以從方差分析和相關(guān)系數(shù)來考察。利用Design-Expert軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。由表3可知，X2、X1X2和X1X3對響應(yīng)值有顯著影響；X1、X3、X12、X22和X32對響應(yīng)值極顯著。此外，F(xiàn)值的大小也反應(yīng)了各因子對響應(yīng)值影響的強弱，F(xiàn)值越大，表明該因子對響應(yīng)值的影響越強。而F（X1）＞F（X3）＞F（X2）表明所選的3個因素中，提取溫度對多酚提取率影響最大，料液比次之，乙醇體積分?jǐn)?shù)相對最小。整體模型極為顯著（P值＜0.000 1），說明各次試驗的該模型的預(yù)測值與實測值比較相符的；失擬項不顯著（P=0.367 6＞0.05），說明該模型失擬項不顯著，即該模型對于實驗數(shù)據(jù)的擬合度較好。其相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，R2Adj=0.995 1，也說明該模型擬合程度較好，其響應(yīng)值數(shù)據(jù)的變化有99.51%來自于所選變量，即來源于乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取料液比。因此，可以用此模型對火棘果多酚的提取進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance of Box-Behnken experiments

2.2.2因素間的交互影響

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖。將一個因素設(shè)為中心值，描繪出對應(yīng)兩因素的三維響應(yīng)面圖，能直觀考察各因素對火棘果多酚提取率的影響及各因數(shù)之間的相互作用。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［15］。

采用Design Expert V8.0.6.1軟件依回歸方程式繪制響應(yīng)面圖及等高線，結(jié)果見圖6。由圖6可知，提取溫度和料液比對火棘果中多酚提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線變化幅度較大；其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，表現(xiàn)為曲線變化幅度平緩，這與方差分析的的結(jié)果一致。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。比較3組圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度之間的交互作用最為顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形；相比較而言，提取溫度和料液比之間的交互作用次之；乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間的交互作用不顯著，表現(xiàn)為等高線呈圓形。

圖6　乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effect of interaction between ethanol concentration，extraction temperature，liquid-solid ratio on polyphenol extraction efficiency

2.3驗證試驗結(jié)果

為確定各因素的最佳取值，利用Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸模型預(yù)測，得到的最佳提取工藝條件為：乙醇提取體積分?jǐn)?shù)70.55%，提取溫度69.54℃，提取料液比1∶21.21（g∶mL），該條件下多酚提取率預(yù)測值為2.85%。為了檢驗試驗結(jié)果與理論情況是否一致，并考慮實際操作條件，在提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取料液比1∶20 （g∶mL），提取時間4.0 h，提取次數(shù)3次的條件下進(jìn)行3次平行試驗，得出實際多酚提取率為2.84%。驗證值略低于預(yù)測值，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的多酚提取條件可靠。

3　結(jié)論

建立了一個以火棘果多酚提取率為目標(biāo)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比為評價因素，多酚提取率為評價指標(biāo)，建立響應(yīng)面模型。方差分析結(jié)果表明該模型擬合較好。通過DesignExpert軟件對回歸方程進(jìn)行優(yōu)化計算，得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，料液比1∶20（g∶mL）?；貧w模型可較好的預(yù)測火棘果多酚的提取率，為綜合利用火棘果資源提供了依據(jù)。為了驗證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述最佳提取條件進(jìn)行3次驗證試驗，并得到的平均多酚提取率為2.84%，與預(yù)測值2.85%基本相符，說明響應(yīng)面優(yōu)化法對火棘果多酚提取條件的優(yōu)化是可行的。該研究也為大別山區(qū)其他特色資源的綜合利用提供了一定的借鑒。

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Optimization of po1ypheno1s extraction techno1ogy fromPyracantha fortuneanafruit by response surface methodo1ogy

WU Wei1，2，LI Ge2，XIANG Fu1，3* （1.Hubei Co11aborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exp1oitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；2.Medica1 Co11ege，Hubei Po1ytechnic University，Huangshi 435003，China；3.Co11ege of Life Sciences，Huanggang Norma1 University，Huangzhou 438000，China）

UsingPyracantha fortuneanaas raw materia1，po1ypheno1 was extracted using ethano1 as extraction so1vent.On the basis of sing1e factor experiment，the optima1 extraction condition was determined by three factors and three 1eve1s Box-Behnken experiment as fo11ows:ethano1 concentration 70%，extraction temperature 70℃，time 4 h，so1id-1iquid ratio 1∶20（g∶m1），and extraction times 3.Under this conditions，the verification resu1ts showed that the po1ypheno1s extraction rate was 2.84%，which was approached to the theoretica1 va1ue 2.85%.

Pyracantha fortuneanafruit；po1ypheno1s；extraction；response surface methodo1ogy

R284.2

A

0254-5071（2015）12-0127-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.028

2015-10-11

大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2015TD07）

吳偉（1979-），男，副教授，博士，研究方向為生物技術(shù)制藥。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向為天然植物資源利用。