黃連素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張亞軍，錢立庭，陳昌杰

黃連素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張亞軍1，2，錢立庭1，陳昌杰3

目的 研究黃連素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖和凋亡的影響以及機(jī)制。方法 用不同濃度的黃連素（0、10、20、40）g/ml處理人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，MTT法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響;Western blot法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP 和 Cleavage-Caspase3表達(dá)。結(jié)果 黃連素呈濃度依賴性地誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的增值抑制和凋亡，上調(diào)Bax、Cleavage-PARP和Cleavage-Caspase3表達(dá)，下調(diào) p-JAK2、p-STAT3和 Bcl-2，對(duì) JAK2和STAT3表達(dá)無(wú)明顯影響。但高表達(dá)p-STAT3的MCF-7細(xì)胞可以抑制黃連素的減少增殖和促進(jìn)凋亡作用。結(jié)論 黃連素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路。

黃連素;MCF-7;增殖;凋亡;JAK2/STAT3

乳腺癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性健康［1］。目前乳腺癌主要選擇手術(shù)、放療和化療等，但治療創(chuàng)傷大且并發(fā)癥多［1－2］。因此尋找有效、低毒、副作用小的治療乳腺癌的方案成為緊迫而現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題。傳統(tǒng)中國(guó)草本藥物有廣泛的生物和藥用價(jià)值，已經(jīng)應(yīng)用數(shù)千年，具有有效、安全性高、易獲取、低價(jià)格等特性，所以近20年來(lái)尋求傳統(tǒng)中藥用于腫瘤治療和預(yù)防的研究成為熱點(diǎn)。黃連素是從黃連、黃柏、血紅小檗等植物的根莖中分離提取出來(lái)的天然生物堿，有抗氧化效應(yīng)和多種藥理特性。研究［3－7］表明（包括體內(nèi)和體外研究），黃連素對(duì)骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、白血病都有一定的抗腫瘤作用，而且研究［8］顯示黃連素對(duì)人體正常細(xì)胞沒(méi)有毒性。黃連素抗腫瘤的機(jī)制主要與抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生長(zhǎng)和延遲腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)［9］。而乳腺癌的發(fā)病機(jī)制是增殖過(guò)度和凋亡受阻［1－2，10］。該研究以人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7 為靶細(xì)胞，探討黃連素對(duì)乳腺細(xì)胞株MCF-7作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（ATCC）;黃連素購(gòu)自陜西賽德高科技生物股份公司，經(jīng)高效液相色譜儀（HPLC）鑒定純度超過(guò)95%，分子式為C20H18ClNO4;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibgo公司;小牛血清購(gòu)自中國(guó)浙江天杭生物科技公司;12孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)BD法康公司;β-actin抗體購(gòu)自中國(guó)艾比瑪特公司;Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleavage-PARP、Cleavage-Caspase3 購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司;JAK2抗體、p-JAK2抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;人p-STAT3小干擾RNA（siRNA）和對(duì)照組siRNA均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;蛋白裂解液RIPA、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢碧云公司;cocktail蛋白酶抑制劑及Western blot凝膠配制試劑盒購(gòu)自中國(guó)谷歌生物科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 以適量濃度的MCF-7細(xì)胞分別接種于含有10%小牛血清RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，再加入濃度為100 U/ml的青霉素和濃度為100 U/ml的鏈霉素;在37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。高表達(dá)p-STAT3的MCF-7細(xì)胞是用包含pRC/CMV-vecto或pRC/CMV-STAT3C-標(biāo)記的質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染獲得。

1.3 儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦熒光顯微鏡均購(gòu)自日本Olympus公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)羅氏公司;ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bi-pech公司;膠片及化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自美國(guó)Kodak公司。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以濃度為1×105/ml加入12孔板內(nèi)，每孔 90 μl;加入黃連素 0、10、20、40 g/ml，劑量參考文獻(xiàn)［5］，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置12孔板于恒溫37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT溶液20 μl;繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，然后每孔加入三聯(lián)裂解液100 μl溶解，避光放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定吸光度（optical density，OD）值，試驗(yàn)重復(fù)3次;根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照孔OD值－實(shí)驗(yàn)孔OD值）/（對(duì)照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

1.5 Annexin-V雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以濃度1×105/ml加入6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后;收集各組所有懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1 ×105/ml，每孔90 μl。加入黃連素（0、10、20、40 g/ml），收集1 ml細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入離心管，1 000 r/min離心5 min;棄去培養(yǎng)基，加RNA酶，37℃水浴1 h;放入冰浴，然后分別加入碘化丙啶（PI）及Annexin V，輕輕搖勻后避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析軟件采用 CELIQUEST。

1.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞 JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、Cleavage-PARP 和Cleavage-Caspase3表達(dá) 將各濃度組收集的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗后，根據(jù)蛋白裂解液RIPA操作說(shuō)明書進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定，將各組蛋白濃度調(diào)成一致，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性后待用。取各組細(xì)胞總蛋白樣品80 μg，以樣品中的β-actin為內(nèi)參，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜取出后進(jìn)行標(biāo)記，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1∶1 000），p-JAK2（1 ∶500），STAT3（1 ∶1 000），p-STAT3（1 ∶500），Bax（1 ∶500），Bcl-2（1 ∶500），Cleavage-PARP（1∶500）和 Cleavage-Caspase3（1 ∶500），表達(dá) β-actin（1∶3 000）抗體，4℃避光過(guò)夜孵育，結(jié)束后用PBS沖洗膜3次，每次10 min。根據(jù)一抗來(lái)源的不同，然后再加入含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶500）、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶5 000）室溫下?lián)u床孵育2 h，結(jié)束后用PBS沖洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光試劑盒化學(xué)發(fā)光顯色、壓片、顯影、定影、膠片拍照掃描保存。用Ge-l Pro Analy zer（Ver 3.0）軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，分析計(jì)算 JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、cleavage-PARP 和 cleavage-Caspase3與β-actin內(nèi)參條帶灰度值的比值，將上述蛋白表達(dá)量化。

1.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和干擾 MCF-7細(xì)胞利用質(zhì)粒和LipofectamineTM2000，轉(zhuǎn)染高表達(dá)激活形式的 p-STAT3，使MCF-7細(xì)胞高表達(dá)p-STAT3;在轉(zhuǎn)染24 h后，將高表達(dá)p-STAT3的MCF-7細(xì)胞分別用黃連素和培養(yǎng)基。72 h后利用MTT和凋亡試劑盒測(cè)增值和凋亡。MCF-7利用 siRNASTAT3和 LipofectamineTM2000，沉默 STAT3，使 MCF-7細(xì)胞低表達(dá)STAT3，在轉(zhuǎn)染24 h后，將低表達(dá)p-TAT3的MCF-7細(xì)胞分別用黃連素和培養(yǎng)基，72 h后利用MTT和凋亡試劑盒測(cè)增殖和凋亡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示;兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素可以呈濃度依賴性抑制MCF-7細(xì)胞增殖，在40 μg/ml達(dá)到最大抑制率（P＜0.05）。見圖1。

2.2 黃連素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素可以呈濃度依賴性促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡（F=165，P＜0.05）。Western blot顯示，黃連素可以促進(jìn)Bcl-2的降解（F=109，P＜0.05）和上調(diào) Bax、Clevage-Caspase3和 Clevage-PARP 的表達(dá)（F=143、126、109，P＜0.05）。見圖2、3。

2.3 黃連素對(duì) MCF-7細(xì)胞 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表達(dá)的影響 Western blot顯示，黃連素可以呈濃度依賴性促進(jìn)p-JAK2、p-STAT3表達(dá)下調(diào)（F=113、102，P＜0.05），但對(duì) JAK2、STAT3表達(dá)無(wú)明顯影響（F=6.0、3.2）。顯示黃連素可以抑制MCF-7細(xì)胞JAK2/STAT3的激活。見圖4。

2.4 黃連素通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)MCF-7增殖抑制和凋亡 在MCF-7細(xì)胞利用質(zhì)粒高表達(dá)p-STAT3可以抑制黃連素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制和凋亡（F=108、156，P＜0.05）。在MCF-7細(xì)胞利用siRNA沉默STAT3表達(dá)，可以增強(qiáng)黃連素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制和凋亡（F=117、128，P＜0.05）。見圖5。

3 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)博大精深，從祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中挖掘出可以抑制乳腺癌惡性增殖的方法是研發(fā)高效低毒抗癌藥的有效途徑之一。黃連素是一種從許多藥用植物中分離出來(lái)的異喹啉類生物堿，其具有抗氧化作用及多種藥理學(xué)特性，臨床上一直用于清熱解毒和治療腹瀉［9］。黃連素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖的的作用在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和肝癌來(lái)源的多種細(xì)胞系中都得到了證明［10－12］。黃連素同時(shí)也調(diào)節(jié)一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞因子刺激信號(hào)可以通過(guò)多條細(xì)胞通路傳入到細(xì)胞內(nèi)，引導(dǎo)細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激做出反應(yīng)，然后協(xié)調(diào)和適應(yīng);JAK-STAT信號(hào)通路是在信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用，與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡密切相關(guān)［13－14］。目前研究［15－16］表明JAK-STAT信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控方面扮演著十分重要的角色。

本試驗(yàn)顯示黃連素可以呈濃度依賴性的誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制和凋亡，上調(diào)Bax、cleavage-PARP和 cleavage-Caspase3的表達(dá)，下調(diào)p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2，但對(duì)JAK2和STAT3表達(dá)無(wú)明顯影響。為了進(jìn)一步證實(shí)黃連素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡受阻是通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路，利用質(zhì)粒和小干擾RNA分別高表達(dá)和低表達(dá)p-STATA3和STAT3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高表達(dá)p-STAT3的MCF-7細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞相比，黃連素誘導(dǎo)的增殖抑制和凋亡明顯減少;低表達(dá)STAT3的MCF-7細(xì)胞與未干擾的MCF-7細(xì)胞相比，黃連素誘導(dǎo)的增殖抑制和凋亡明顯增強(qiáng)，這顯示黃連素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路。

綜上所述，黃連素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路。但是黃連素作用機(jī)制仍不清楚，可能系直接作用于JAK2信號(hào)分子或者通過(guò)調(diào)節(jié)其上游激酶和/或信號(hào)分子而發(fā)揮著間接作用。黃連素在乳腺癌中的定義、潛在應(yīng)用及作用靶點(diǎn)仍然是一個(gè)重要的問(wèn)題。更好地理解黃連素調(diào)控的細(xì)胞通路，無(wú)疑將能更好地理解其在乳腺癌的發(fā)病機(jī)理和治療方面的應(yīng)作用，將會(huì)進(jìn)行進(jìn)一步更深入的研究，探討是否其他信號(hào)通路調(diào)控黃連素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡。

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Effect of berberine on proliferation and apoptosis of MCF-7 cells

Zhang Yajun1，2，Qian Liting1，Chen Changjie3
（1Dept of Radiation Oncology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001;2Dept of Radiation Oncology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu233004;
3Dept of Biochemistry＆Molecular Biology，Bengbu Medical College，Bengbu233030）

ObjectiveTo investigate the effect and mechanisms of the Berberine on the human breast adenocarcinoma cell line MCF-7.MethodsMTT method was used to evaluate the proliferation effect of MCF-7 and the percentage of apoptotic cells were determined by flow cytometric analysis.The expressions of JAK2，p-JAK2，p-STAT3，STAT3，Bax，Bcl-2，Cleavage-PARP and Cleavage-Caspase3 were detected by Western blotting.ResultsThe results showed that BBR treatment decreased the activation of JAK2/STAT3 signal pathway and up-regulated the expression of Bax，Caspase3 and PARP activation with the decrease of the expression of Bcl-2.Wherefore，expression of the constitutively active form of STAT3 could attenuate the effect of BBR on the MCF-7 cell.ConclusionBerberine can induces apoptosis and proliferation inhibition of breast adenocarcinoma cell lines of MCF-7 through inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathway.

berberine;MCF-7;proliferation;apoptosis;JAK2/STAT3

R 739.9

A

1000－1492（2015）09－1276－05

2015－05－18接收

安徽高校省級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào):KJ2013A184）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤放療科，合肥 2300012蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，蚌埠 2330043蚌埠醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，蚌埠 233030

張亞軍，男，副主任醫(yī)師;

錢立庭，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:money2004@sina.com