SPA單結(jié)構(gòu)域突變體組合噬菌體文庫的構(gòu)建及體外進化篩選

林子玉，丁瑩瑩，周 鵬，高彩霞，馮嬌嬌，王錦紅，潘 衛(wèi)，鄧松華，3

SPA單結(jié)構(gòu)域突變體組合噬菌體文庫的構(gòu)建及體外進化篩選

林子玉1，丁瑩瑩2，周 鵬1，高彩霞2，馮嬌嬌2，王錦紅2，潘 衛(wèi)2，鄧松華1，3

目的 使用人免疫球蛋白G（IgG）對金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）單結(jié)構(gòu)域突變體組合文庫進行體外分子進化篩選，判斷不同突變體組合的特異結(jié)合優(yōu)勢，探索優(yōu)勢組合分子結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系。方法 通過Overlap PCR獲得SPA中A和C單結(jié)構(gòu)域突變體片段組合構(gòu)成的噬菌體文庫，再使用人IgG對文庫進行體外親和篩選，期望通過對特定結(jié)合分子的定向改造及體外進化獲得具有高結(jié)合優(yōu)勢的組合分子。結(jié)果 成功構(gòu)建符合體外篩選要求的SPA單結(jié)構(gòu)域A在29、30位氨基酸定點突變文庫（A1）、SPA單結(jié)構(gòu)域C在36、37位定點突變文庫（C1）和SPA單結(jié)構(gòu)域A在37位后插入3個氨基酸隨機肽（AI37）、SPA單結(jié)構(gòu)域C在20位后插入3個隨機連接肽（CI20），將A1、C1隨機組合構(gòu)建的噬菌體展示文庫命名為庫A1C1，將AI37、CI20隨機組合構(gòu)建的噬菌體展示文庫命名為庫AI37CI20。兩個文庫各自經(jīng)過4、5輪親和篩選，文庫進化完全。Phage-ELISA高光密度值的單克隆，測序結(jié)果分析為A（Q29K30）A（I29I30）和AI-TQSA。結(jié)論 通過定向改造技術(shù)獲得了高結(jié)合能力的定點突變分子A（Q29K30）A（I29I30）和插入突變分子AI37-TQSA，為Ig結(jié)合分子的定向改造及具有新的Ig結(jié)合特性的重組Ig結(jié)合分子的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

AC突變體;噬菌體展示文庫;篩選;人免疫球蛋白G

自然界中許多細菌表達多種與宿主免疫球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原等血清蛋白有結(jié)合活性的蛋白［immunogiobulin（Ig）-binding protions，IBPS］［1］，介導細菌致病性。其中，典型代表有金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）、鏈球菌蛋白G及大消化鏈球菌蛋白 L［2－4］。是由多個同源序列首尾相連構(gòu)成，Protein A中分別命名為 E、D、A、B和 C，單個結(jié)構(gòu)域由3個反向平行的螺旋組成，單獨即具有Ig結(jié)合活性［5］。該研究應用分子定向改造及體外分子進化平臺獲得了更高結(jié)合活性的非天然存在的新型免疫球蛋白結(jié)合分子 D-C［6］、A-C［7］、AL（VV）［8］等。在此基礎(chǔ)上，該研究通過對A-C中單結(jié)構(gòu)域進行定向改造隨機組合構(gòu)成的噬菌體文庫，應用人IgG分子進行體外進化篩選，分別獲得了具有特意結(jié)合優(yōu)勢的新型組合分子A（Q29K30）A（I29I30）和AI37-TQSA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒載體和菌株 噬菌粒載體 pCANTAB5S-SPA AC質(zhì)粒由第二軍醫(yī)大學病原生物教研室構(gòu)建保存，輔助噬菌體M13K07;大腸桿菌Top10、E.coliTG1;噬菌粒載體pCANTAB5S由第二軍醫(yī)大學病原生物教研室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Xba I、堿性磷酸酶購自寶生物工程（上海）公司;DNA Taq酶購自日本TaKaRa公司;高效連接液購自日本TOYOBO公司;氨芐青霉素與卡那霉素均購自上海華美生物公司;質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;人免疫球蛋白G（intravenous gamma globulin，IgG）由第二軍醫(yī)大學病原生物教研室制備。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)本實驗室保存的堿基序列設(shè)計13條引物，見表1。應用13條引物進行Overlap PCR構(gòu)建A-C突變體單結(jié)構(gòu)域DNA片段，且片段兩端引入Xba I酶切位點及53 bp保護堿基。PCR擴增鑒定噬菌粒pCANTAB5S中克隆片段及測序上游引物為PCANTAB5S-1序列:5'-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3'，下 游 引 物 PCANTAB5S-6序列:5'-GTAAATGAATTTTCTGTTATGAGG-3'。以上引物均由上海生工生物工程科技服務有限公司合成。

1.2.2 A-C單結(jié)構(gòu)域突變體組合文庫的構(gòu)建 以PCANTAB5S-SPA AC質(zhì)粒為模板，以UA1和DA1，UC1和DC1，UA1和Da1，UC1和Dc1為上下游引物PCR 擴增 A1-1、C1-1、AI37-1、CI20-1，以 UA2 和 DA2，UC2和DC2，Ua2和DA2，Uc2和DC2 PCR擴增 A1-2、C1-2、AI37-2、CI20-2，再用overlap PCR 技術(shù)，以UA1和DA2，UC1和DC2為上下游引物合成完整的在不同位點定向改造的突變體A1、C1、AI37、CI20片段。同時為提高酶切效率在上下游引入保護堿基Sec，以上面4個突變體單結(jié)構(gòu)域片段為模板，PCR擴增到最終含53 bp保護堿基的4個單結(jié)構(gòu)域片段。將4個片段PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)Xba I酶切，與同時酶切并CIAP酶去磷酸化處理的PCANTAB5S連接后轉(zhuǎn)化TG1超級感受態(tài)細胞［9］。取1 μl菌液稀釋后涂2×YT平板（Amp），計算庫容。挑22個單克隆PCR鑒定，選含2個 domain陽性單克隆菌種，委托杰李基因科技股份有限公司序列測定，分析文庫突變點序列隨機性。剩余菌液擴大培養(yǎng)到7 ml 2×YT培養(yǎng)基（Amp）中，37℃ 225 r/min培養(yǎng)到對數(shù)期;加800 μl滴度1.3×1012TU/L M13K07輔助噬菌體，37℃ 225 r/min離心1 h;加9 μl Kana，37 ℃ 225 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。過夜菌液經(jīng)11 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液即原代噬菌體文庫。測定滴度［10］。

表1 A-C單結(jié)構(gòu)域突變體片段的擴增引物

1.2.3 人IgG對SPA AC突變體組合噬菌體文庫的體外分子進化篩選 應用人IgG對上述構(gòu)建的噬菌體文庫進行4、5輪體外分子進化篩選，具體步驟參見相關(guān)文獻［11］。篩選中空噬菌體數(shù)的減少和多結(jié)構(gòu)域的增加是篩選進度的監(jiān)測指標。在構(gòu)建文庫中發(fā)現(xiàn)5S自連即零插入噬菌體占很少比例，所以將原代文庫與5S等比例混合構(gòu)成篩選起始文庫。

1.2.4 對篩選后文庫中隨機突變體單克隆噬菌體的phage ELISA檢測 將兩個篩選后的庫質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)，涂2×YT平板（Amp），37℃過夜培養(yǎng)。從兩個文庫轉(zhuǎn)化的平板上各隨機挑取90個單克隆，分別接種于1.5 EP管中，于1 ml 2×YT（Amp）中培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)輔助噬菌體M13K07拯救，制備成不同單克隆來源的單克隆噬菌體。相同方法制備3個野生型AC單克隆噬菌體和3個PCANTAB5S空噬菌體。將制備好的不同來源的單克隆噬菌體100 μl加入用人IgG包板的ELISA排條中，37℃，2 h后用PBST洗5次，加入抗噬菌體酶聯(lián)單抗結(jié)合，37℃，2 h后用PBST洗5次，TMB顯色后450 nm讀取光密度（optical density，OD）數(shù)值，檢測各單克隆噬菌體與人IgG的結(jié)合活性。挑取高OD值的單克隆噬菌體送測序。

1.2.5 ELISA法驗證優(yōu)勢突變組合分子噬菌體結(jié)合活性 將優(yōu)勢突變組合分子A（Q29K30）A（I29I30）和AI37-TQSA的單克隆劃LB（Amp），37℃培養(yǎng)過夜。為確保結(jié)果真實可靠，隨機挑取7個菌落分別接種于7管2×YT培養(yǎng)基（Amp）中，經(jīng)M13K07拯救，制備7管具有相同展示物卻來自不同單克隆的噬菌體，測滴度后作平行組實驗。同樣制備 PCANTAB5S-AC噬菌體和PCANTAB5S噬菌體，作陽性和陰性對照。取100 μl噬菌體加入人 IgG包板的ELISA板條中，37℃2 h用PBST洗5次，加入抗噬菌體酶聯(lián)單抗結(jié)合，37℃2 h后PBST洗5次，TMB顯色后讀取OD450值，檢測單克隆噬菌體與人IgG結(jié)合活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用 SAS 9.1統(tǒng)計軟件對ELISA檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料兩組間比較采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各單結(jié)構(gòu)域突變體片段的構(gòu)建 經(jīng)PCR擴增得到 A1-1、A1-2、C1-1、C1-2、AI37-1、AI37-2、CI20-1、CI20-2，再用Overlap PCR技術(shù)合成完整的在不同位點突變的 A1、C1、AI37、CI20片段;最后，為延長保護堿基提高酶切效率，再次PCR擴增得到兩端分別引入53 bp保護堿基的 A1、C1、AI37、CI20突變體片段見圖1。

2.2 噬菌體文庫的構(gòu)建及插入情況鑒定 將突變片段 A1、C1、AI37、CI20經(jīng) XbaⅠ酶切與同樣酶切并CIAP處理的噬菌粒pCANTAB5S連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)細胞E.coliTG1，文庫的A1C1的庫容和文庫AI37CI20分別為3.0×106和2.0×106，滴度依次為2.3×1012和2.1×1012（TU/ml）。在兩文庫原代中各挑24個轉(zhuǎn)化子，對原代文庫結(jié)構(gòu)域片段插入情況PCR結(jié)果表明，文庫A1C1結(jié)構(gòu)域插入率為90%，文庫AI37CI20結(jié)構(gòu)域插入率為79%。PCR鑒定的的8個插入多個結(jié)構(gòu)域片段的陽性克隆序列測定結(jié)果表明:在插入的噬菌粒上共16個單結(jié)構(gòu)域中，A1:C1:AI37:CI20個數(shù)比為5∶3∶4∶4，具有隨機性。在插入的16個單結(jié)構(gòu)域片段中，插入片段的正反向比為1∶1，總插入片段的正反向也具有隨機性，見表2。所構(gòu)建的文庫符合體外進化篩選要求。

表2 SPA AC突變體組合文庫測序分析

2.3 人IgG對噬菌體展示文庫篩選進化過程 噬菌體文庫中展示兩個結(jié)構(gòu)域噬菌體比例的增加和空噬菌體的減少是監(jiān)測篩選進度及結(jié)果的指標。由圖2可知，篩選進化中，展示兩個結(jié)構(gòu)域片段克隆所占比例不斷穩(wěn)定增加，零插入克隆和單個結(jié)構(gòu)域片段克隆所占比例逐漸減少，最后完全消失，充分體現(xiàn)篩選的有效性。

2.4 ELISA法檢測不同來源的單克隆噬菌體與人IgG的結(jié)合力 將制備好的96孔不同來源的單克隆噬菌體加入人IgG包板的ELISA板條，與M13二抗結(jié)合，TMB顯色讀取OD450數(shù)值結(jié)果顯示，兩個文庫中都出現(xiàn)了與野生型AC結(jié)合力相當，甚至高與其他單克隆噬菌體。兩文庫的96孔單克隆噬菌體Phage ELISA結(jié)果見圖3。

2.5 ELISA法檢測優(yōu)勢突變分子與人IgG的結(jié)合力 將A（Q29K30）A（I29I30）、AI37-TQSA、PCANTAB5S-AC 和PCANTAB5S共4組分別制備7個單克隆噬菌體，并將滴度均調(diào)整為約1.0×1012TU/ml后相同條件下進行ELISA法比較各組噬菌體分別對人IgG的結(jié)合活性。結(jié)果顯示A（Q29K30）A（I29I30）噬菌體和AI37-TQSA噬菌體結(jié)合能力都強于PCANTAB5S-AC噬菌體，A1與AC比較差異無統(tǒng)計學意義（Chi=1.434，P=0.838），A2與AC比較差異有統(tǒng)計學意義（Chi=9.882，P=0.042），見圖 4。

2.6 人IgG對文庫A1C1和文庫 AI37CI20挑取高OD值結(jié)果測序 文庫A1C1經(jīng)過4輪親和篩選，文庫AI37CI20經(jīng)過5輪親和篩選，PCR鑒定結(jié)果顯示文庫進化統(tǒng)一為2個domain的片段，表明進化完全。分別在最后一代挑96個單克隆制備成單克隆噬菌體，取OD值最高的單克隆噬菌體送測序，測序結(jié)果分析文庫A1C1最終進化完全為A（Q29K30）A（I29I30），文庫AI37CI20最終進化完全為AI37-TQSA。

3 討論

噬菌體表面展示技術(shù)是于1985年首先建立起來的一種新的生物技術(shù)，能將外源多肽展示于噬菌體表面，并能保持相對獨立的空間構(gòu)像和原有生物活性［12］。本實驗對SPA（AC）單結(jié)構(gòu)域A在29、30位氨基酸定點突變建成文庫（A1）、SPA單結(jié)構(gòu)域C在36、37位定點突變建成文庫（C1）和SPA單結(jié)構(gòu)域A在37位后插入3個氨基酸隨機肽建成文庫（AI37）、SPA單結(jié)構(gòu)域C在20位后插入3個隨機連接肽建成文庫（CI20），將A1、C1隨機組合構(gòu)建的噬菌體展示文庫命名為庫A1C1，將AI37、CI20隨機組合構(gòu)建的噬菌體展示文庫命名為庫AI37CI20。兩個文庫的庫容分別為3.0×106和2.0×106，滴度依次為2.3×1012和2.1 ×1012（TU/ml）。文庫的插入率分別為90%和79%，具有2個Domain片段測序結(jié)果表明文庫的插入情況、正反向比例都具有隨機性，達到篩選要求。再應用人IgG分子進行體外進化篩選，展示2個Domain片段逐漸富集，展示1個Domain片段和空載體逐漸減少和消失，篩選到第4、5代時，文庫全部進化為兩個結(jié)構(gòu)域組合分子，表明文庫進化完全，體現(xiàn)篩選的有效性。在兩文庫的第4、5代各挑取96個單克隆制備成單克隆噬菌體，phage ELISA獲得高OD值的單克隆測序結(jié)果為A（Q29K30）A（I29I30）和 AI37-TQSA。

SPA是細菌表面與宿主抗體結(jié)合的蛋白，各單結(jié)構(gòu)域都可與哺乳動物IgG的Fc結(jié)合，該結(jié)合一螺旋1和螺旋2與Fc的疏水作用為主，并通過分子間的四對氫鍵得到進一步的穩(wěn)定［13］，是有價值的診斷、治療和抗體制備工具。此文庫對SPA各單結(jié)構(gòu)域重組后的具有特異優(yōu)勢結(jié)合后免疫球蛋白結(jié)合蛋白分子AC進行分子突變重組定向改造，以進一步探索結(jié)合特性。由圖5所示*號所標記的氨基酸位點為與IgG結(jié)合位點［8］，對A（Q29K30）A（I29I30）突變體的分析結(jié)果表明兩個單結(jié)構(gòu)域都是在29、30位GF突變體中得到，說明在足夠庫容的情況下螺旋2中氨基酸的改變是可以影響其與Fc段的結(jié)合能力，達到增加結(jié)合力的效果。對AI37-TQSA突變體分析表明延長螺旋2和螺旋3之間的長度，將SPA A與Fc段的結(jié)構(gòu)構(gòu)像進行優(yōu)化調(diào)整，從而提高了結(jié)合活性。在插入突變文庫AI37CI20中所獲得的高結(jié)合力免疫球蛋白結(jié)合分子AI37-TQSA之所以會有野生型A的出現(xiàn)，經(jīng)過分析很可能是因為在第一輪PCR構(gòu)建文庫片段的過程中模板AC濃度過高，以至于在Overlap PCR過程中以殘留原始模板AC優(yōu)先合成野生型A結(jié)構(gòu)域，參與了后面的酶切與連接，這個也是以后做此類實驗中要注意的一點，以免影響文庫構(gòu)建的質(zhì)量。

在文庫A1C1中選擇在每個單結(jié)構(gòu)域突變兩個結(jié)合位點，主要考慮單個位點的突變可能對構(gòu)象的影響不大，同時設(shè)置的突變位點相鄰，可以很容易設(shè)計引物實現(xiàn)多位點的突變，且每個位點均是隨機突變，可以產(chǎn)生盡可能多氨基酸組合，達到增加優(yōu)勢AC突變體的可能。在文庫AI37CI20中選擇螺旋1和螺旋2之間，螺旋2和螺旋3之間加入3個隨機連接肽是因為在空間結(jié)構(gòu)上這個位置與IgG的Fc結(jié)合位點位置離的最近，更容易對構(gòu)象產(chǎn)生影響。

免疫球蛋白結(jié)合分子其獨特抗體結(jié)合特性已被廣泛用于抗體檢測、抗體純化、免疫沉淀研究和免疫吸附治療。對免疫球蛋白的定向人工改造可提高其對抗體結(jié)合能力，提高應用價值，顯示應用前景。

［1］Housden N G，Harrison S，Roberts S E，et al.Immunoglobulinbinding domains:Protein L from Peptostreptococcus magnus［J］.Biochem Soc Trans，2003，31（Pt 3）:716－8.

［2］Atkins K L，Burman J D，Chamberlain E S，et al.S.aureus IgG-binding proteins SpA and Sbi:host specificity and mechanisms of immune complex formation［J］.Mol Immunol，2008，45（6）:1600－11.

［3］Goward C R，Scawen M D，Murphy J P，et al.Molecular evolution of bacterial cell-surface proteins［J］.Trends Biochem Sci，1993，18（4）:136－40.

［4］Nomellini J F，Duncan G，Dorocicz I R，et al.S-layer-mediated display of the immunoglobulin G-binding domain of streptococcal protein G on the surface of Caulobacter crescentus:development of an immunoactive reagent［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（10）:3245－53.

［5］Ramsland P A，Willoughby N，Trist H M，et al.Structural basis for evasion of IgA immunity by Staphylococcus aureus revealed in the complex of SSL7 with Fc of human IgA1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（38）:15051－6.

［6］祁培培，丁瑩瑩，吳莉莉，等.人IgG四亞類對噬菌體展示Ig結(jié)合蛋白單結(jié)構(gòu)域隨機組合文庫的體外進化篩選［J］.生物工程學報，2012，28（9）:1093－105.

［7］徐文竹，丁瑩瑩，吳莉莉，等.不同亞類小鼠IgG對SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的隨機組合噬菌體文庫的體外進化研究［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2014，49（9）:1227－33.

［8］He T，Ding Y Y，F(xiàn)eng J J，et al.In vitromolecular evolution of AL NEIBMs improved immunoglobulin（Ig）binding and antibody detection［J］.J Biotechnol，2014，184:118－27.

［9］葛宜兵，楊旭芳，杜哲明，等.噬菌體展示HIV-1 Tat38-61堿性區(qū)51和55位隨機突變體文庫的構(gòu)建［J］.生物工程學報，2011（5）:755－63.

［10］沈毅珺，潘 衛(wèi)，許 燕，等.噬菌體展示重組人淋巴毒素突變體庫及受體親和篩選［J］.生物化學與生物物理進展，2005（1）:75－80.

［11］Yang H，Cao J，Li L Q，et al.Evolutional selection of a combinatorial phage library displaying randomly-rearranged various single domains of immunoglobulin（Ig）-binding proteins（IBPs）with four kinds of Ig molecules［J］.BMC Microbiol，2008，8:137.

［12］Tikunova N V，Morozova V V.Phage display on the base of filamentous bacteriophages:application for recombinant antibodies selection［J］.Acta Naturae，2009，1（3）:20－8.

［13］Uhlén M，Guss B，Nilsson B，et al.Complete sequence of the staphylococcal gene encoding protein A.A gene evolved through multiple duplications［J］.J Biol Chem，1984，259（3）:1695－702.

Construction and evolutional selection of a combinatorial phage library displaying randomly-rearranged mutant binding domains of SPA

Lin Ziyu1，Ding Yingying2，Zhou Peng1，et al
（1Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032;2Dept of Medical Microbiology and Parasitology，The Second Military Medical University，Shanghai200433）

ObjectiveUsing human IgG direct evolutional selection of a combinatorial phage library displaying randomly-rearranged mutant binding domains of SPA，judging the advantages of the specific combination of different mutations and exploring the relationship between the structure and the function.MethodsWith using overlap PCR，A and C single structure domain mutant fragments in the protein A（SPA）staphylococcus could be obtained.And then used human IgG to affinity screening the phage library，expecting to obtain the integrate molecule with a high combination advantage，through directional transform the particular combinational molecular and evolving itin vitro.ResultsTwo libraries could meet the requirement for the in vitro molecular evolution.SPA single domain structure A in 29，30 amino acids site-directed mutation was library（A1），structure C in 36，37 site-directed mutation was library（C1），SPA single domain structure A insert 3 amino acids after 37 random peptide was library（AI37），SPA single domain structure C after 20 insert 3 random peptide was library（CI20）.The phage display library which was made up of a random combination of A1 and C1 named“A1C1”.And the phage display library which was made up of a random combination of AI37and CI20named“AI37CI20”.The capacity of these two libraries were respectively:3.0×106and 2.0×106.The titers were respectively:2.3×1012and 2.1×1012（TU/ml）.These two libraries had evolved completely through four or five times of affinity screening.Besides，Phage-Elisa monoclonal obtained a monoclonal with high OD，and the testing analytical result was A（Q29K30）A（I29I30）and AI37-TQSA.ConclusionA fixed point mutation molecules A（Q29K30）A（I29I30）and insertion mutation molecular AI37-TQSA are obtained with the high combining ability.The study shows the relationship of the structure and function of Ig-binding molecules and lays a foundation for directed improvement of Ig-binding molecules and acquirement of new Igbinding molecules with new Ig-binding characteristics.

AC mutants;phage-displayed library;selection;human IgG

R 392.7

A

1000－1492（2015）09－1262－06

2015－04－29接收

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（編號:SS2014AA021403）;國家自然科學基金（編號:30872405、30472050、30972632）;上海市科學技術(shù)委員會科研計劃項目（編號:08JC1405200）

1安徽醫(yī)科大學病理生理學教研室，合肥 230032

2第二軍醫(yī)大學病原生物學教研室，上海 2004333安慶醫(yī)藥高等?？茖W校，安慶 246052

林子玉，女，碩士研究生;

潘 衛(wèi)，男，博士生導師，責任作者，E-mail:weipan@yahoo.com;

鄧松華，男，碩士生導師，責任作者，E-mail:desoh@126.com