朱文祥，謝學(xué)輝，馮 帆，柳建設(shè)

(東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

茚三酮定量蛋白質(zhì)方法的改進

朱文祥，謝學(xué)輝，馮 帆，柳建設(shè)

(東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

首次結(jié)合高溫堿裂解和乙二醇體系反應(yīng)液的優(yōu)勢，對茚三酮定量蛋白質(zhì)的方法進行了改進，同時對測量過程中的關(guān)鍵參數(shù)進行了優(yōu)化，確定了測量波長為570nm、裂解時間為15min、顯色時間為15min和冷卻時間為5min.在該改進方法條件下，以BSA(牛血清白蛋白)作為標準樣品繪制了標準曲線，驗證了該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性.將該方法與茚三酮直接測定法和考馬斯亮藍染色法進行比較，結(jié)果表明其具有更高的靈敏度和準確性，在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景.

茚三酮；堿裂解；乙二醇；考馬斯亮藍

蛋白質(zhì)的準確定量是生物、醫(yī)學(xué)、食品、法醫(yī)、環(huán)境等領(lǐng)域的常見問題[1].蛋白質(zhì)定量法主要有凱氏定氮法、紫外吸收法、Lowry法、BCA(bicinchoninic acid)法，這些方法都具有操作過程復(fù)雜、影響因素較多、準確性和靈敏度較低等缺陷[2].考馬斯亮藍染色法操作簡便，受到廣大科研工作者的親睞[3]，但該法靈敏度低、準確性較差[3-5].因此，尋找一種靈敏、準確、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)定量法迫在眉睫.

茚三酮在酸性的還原性環(huán)境下能與氨基酸、蛋白質(zhì)中的α-氨基迅速反應(yīng)，產(chǎn)物羅曼紫(Ruhemann’s purple)在波長560～580nm有吸收峰[6].該方法被廣泛應(yīng)用于食品、法醫(yī)、臨床診斷等領(lǐng)域中氨基酸和蛋白質(zhì)的定性或定量檢測[7-9]，其反應(yīng)機理如圖1所示.文獻[1]報道茚三酮與氨基酸反應(yīng)的靈敏度比與蛋白質(zhì)反應(yīng)高40倍，這是因為相同質(zhì)量下，氨基酸中所含α-氨基的數(shù)量要遠大于蛋白質(zhì)中的數(shù)量.因此，通過茚三酮定量氨基酸來間接定量蛋白質(zhì)含量，其靈敏度和準確度更有保障.

圖1 茚三酮與氨基酸反應(yīng)機理[6]Fig.1 Mechanism of reaction between ninhydrin and animo acids [6]

因此，將蛋白質(zhì)完全裂解成氨基酸后再用茚三酮定量氨基酸是實現(xiàn)蛋白質(zhì)準確定量的新途徑[10].而尋找合適的裂解方式和穩(wěn)定的茚三酮反應(yīng)液是實現(xiàn)茚三酮準確定量蛋白質(zhì)首要解決的兩大難題.目前，茚三酮定量蛋白質(zhì)法中采用兩類蛋白質(zhì)裂解方法，即高溫酸裂解法[5,11-13]和高溫堿裂解法[10,14-15].高溫酸裂解法一般耗時長達4～24h，相比之下，高溫堿裂解法耗時短，裂解效率高，可在0.5h內(nèi)將蛋白質(zhì)完全裂解，并能消除樣品中胺類、核酸等物質(zhì)對茚三酮反應(yīng)的影響[10,14-15]，故高溫堿裂解法更有優(yōu)越性.茚三酮反應(yīng)液的穩(wěn)定性決定定量的準確性[16].以醋酸纖維素、二甲基亞砜、乙醇、丙酮等為溶劑的反應(yīng)液均有報道，但其穩(wěn)定性差，配制過程復(fù)雜，需現(xiàn)配現(xiàn)用[17]，極大限制了茚三酮在定量氨基酸和蛋白質(zhì)的應(yīng)用.文獻[5]的研究發(fā)現(xiàn)，相比廣泛使用的醋酸纖維素和二甲基亞砜，以毒性更低的乙二醇為溶劑能明顯提高顯色液的穩(wěn)定性，能在一個月內(nèi)保持測量的準確性，此外，在配制和保存過程中無需氮氣環(huán)境，更為簡便、經(jīng)濟.

鑒于以上分析，采用高溫堿裂解法裂解蛋白質(zhì)，然后以乙二醇為溶劑的反應(yīng)液定量裂解后的氨基酸，這可能是實現(xiàn)茚三酮法準確定量蛋白質(zhì)的有效途徑.目前，此方面的研究未見報道.因此，本文結(jié)合高溫堿裂解法和乙二醇溶劑下的茚三酮反應(yīng)液的優(yōu)勢，建立改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)的方法，在優(yōu)化測量參數(shù)的基礎(chǔ)上，研究了該改進方法的準確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏性.最后通過與直接茚三酮測定法和考馬斯亮藍染色法對比，驗證了本文改進方法是一種更為實用、靈敏、準確、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)定量方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氫氧化鈉(國藥集團，上海)；茚三酮(Sigma-aldrich，美國)；考馬斯亮藍定量試劑盒(上海生工生物工程有限公司，上海)；微量紫外分光光度計(Implen公司，德國)；高壓滅菌鍋(上海申安儀器有限公司，上海).其他試劑均為分析純.

1.2 蛋白質(zhì)高溫裂解

將蛋白質(zhì)標準液分裝在2 mL離心管中，烘箱中105℃烘干2 h左右.取出后向每只離心管中加入500μL 13.5mol/L的NaOH裂解液，蓋緊離心管管蓋，在漩渦混合器上輕輕混勻后將其放入高壓滅菌鍋高溫裂解.為防止離心管管蓋在高溫高壓環(huán)境下開裂，可用封口膜以橡皮筋固定離心管管蓋.

1.3 茚三酮反應(yīng)液的配制

參照文獻[5]配制茚三酮反應(yīng)液.

1.4 測定流程

取100μL上述蛋白質(zhì)裂解液，加入170μL冰醋酸，輕微振蕩混勻后，加入200μL茚三酮反應(yīng)液，在沸水浴中加熱后室溫下冷卻，取250μL產(chǎn)物加到750μL的50%異丙醇溶液中，在旋渦混合器上劇烈振蕩30s后，由微量紫外分光光度計測定吸光度值.

1.5 最佳測量條件的優(yōu)化

最佳測量波長：茚三酮與含有α-氨基的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成產(chǎn)物在波長560～580nm內(nèi)有特征吸收峰.但據(jù)相關(guān)報道，在不同反應(yīng)條件下產(chǎn)物的最佳吸收波長可為480[18]，565[19]，568[8,20]，570[21]，575nm[5-6].為確定在本文所改進方法下反應(yīng)產(chǎn)物的最佳測量波長，將牛血清白蛋白(BSA)標準液經(jīng)高溫高壓堿裂解，并與茚三酮進行顯色反應(yīng)，將產(chǎn)物在波長450～700nm范圍內(nèi)進行掃描.

最佳裂解時間：裂解時間的長短直接決定蛋白質(zhì)是否完全裂解成游離氨基酸.在裝有蛋白質(zhì)標準液的離心管烘干后加入500μL 13.5mol/L的NaOH裂解液，在高壓滅菌鍋中分別裂解5,10,15,20min，以未加蛋白質(zhì)的裂解液作空白對照，每組做4個平行試驗.

最佳顯色時間：茚三酮與氨基酸反應(yīng)過程中，顯色時間是決定產(chǎn)物生成量的關(guān)鍵因素.在含有蛋白質(zhì)裂解液的離心管中加入200μL茚三酮反應(yīng)液，沸水浴中分別加熱5,10,15,20,25min，以未加蛋白質(zhì)的裂解液作為空白對照，每組做4個平行試驗.

最佳冷卻時間：在沸水浴中生成的反應(yīng)產(chǎn)物需經(jīng)一定時間冷卻才能準確測量.將裝有反應(yīng)產(chǎn)物的離心管放在室溫下分別冷卻0,5,10,15,20min后測量，以未加蛋白質(zhì)的裂解液作為空白對照，每組做4個平行試驗.

1.6 標準曲線及其重復(fù)性檢驗

按照所述的測定流程，分別取含BSA為2,4,6,8,10,20,30,40μg的裂解液與茚三酮反應(yīng)液反應(yīng)，以未加蛋白質(zhì)的PBS(磷酸鹽)緩沖液為空白對照，每組做4個平行試驗，制作蛋白質(zhì)標準曲線.72 h后再次取含BSA為6和8μg的裂解液與上述茚三酮反應(yīng)液反應(yīng)，檢驗該法的重復(fù)性和茚三酮反應(yīng)液的穩(wěn)定性.

1.7 穩(wěn)定性檢驗

本文采用精密度和蛋白質(zhì)的回收率兩個指標來表征所述方法的穩(wěn)定性.精密度以相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示，在空白加標試驗條件下計算蛋白質(zhì)的回收率.此外，為探究在高溫高壓強堿性環(huán)境下氨基酸結(jié)構(gòu)是否遭到破壞，以氨基酸中結(jié)構(gòu)最為簡單的甘氨酸為例，通過本改進方法和本改進方法中省去高溫高壓堿裂解步驟的相對比進行論證.

1.8 靈敏度與準確性分析

采用本文所建立的改進方法，取含BSA、明膠、蛋白酶K和溶菌酶(2,4,6,8,10μg)的裂解液，按照上述測定流程制作蛋白質(zhì)標準曲線.茚三酮直接測定法省去高溫堿裂解步驟，其他步驟與本改進方法一致.考馬斯亮藍染色法按照經(jīng)典的測定流程，分別取含有蛋白質(zhì)量為2,4,6,8,10μg的PBS緩沖液100μL，再加入考馬斯亮藍反應(yīng)液1mL，5min 后測定波長595nm處的吸光度值，制作蛋白質(zhì)標準曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳測量條件優(yōu)化結(jié)果

將反應(yīng)產(chǎn)物在波長450～700nm內(nèi)進行掃描，結(jié)果如圖2(a)所示.由圖2(a)可知，產(chǎn)物在波長570nm 處有最大特征吸收峰.

將BSA標準液在滅菌鍋中高溫堿裂解，其產(chǎn)物吸光度隨裂解時間的變化如圖2(b)所示.結(jié)果表明裂解15min可使蛋白質(zhì)完全裂解為游離氨基酸.

將蛋白質(zhì)裂解液與茚三酮反應(yīng)液混合后在沸水浴中進行顯色反應(yīng)，產(chǎn)物吸光度隨加熱時間的變化趨勢如圖2(c)所示.由圖2(c)可知，隨著加熱時間的延長，產(chǎn)物的吸光度變化不大，說明該顯色反應(yīng)迅速、靈敏、穩(wěn)定，顯色15min后可使游離氨基酸與茚三酮完全反應(yīng)，之后出現(xiàn)略微下降，這是由于羅曼紫降解所致.

將反應(yīng)產(chǎn)物在室溫下冷卻不同時間后再測量其吸光度值，結(jié)果如圖2(d)所示.由圖2(d)可知，產(chǎn)物不經(jīng)冷卻會導(dǎo)致吸光度測量值偏低，冷卻不少于5min后吸光度值保持恒定，同時說明羅曼紫在50%異丙醇溶液中能較長時間穩(wěn)定存在.

綜上分析可知，測量波長為570nm、高溫裂解時間為15min、顯色時間為15min、冷卻時間為5min 為該改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法的最佳測量條件.

圖2 改進的茚三酮法參數(shù)優(yōu)化圖Fig.2 The parameters optimization of the improved ninhydrin assay

2.2 蛋白質(zhì)標準曲線及重復(fù)性檢驗

以該改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法測定的BSA標準曲線如圖3所示.在蛋白質(zhì)量為2～40μg時，蛋白質(zhì)量與吸光度值具有很好的線性關(guān)系(R2=0.996，RSD<0.6)，說明該改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法能準確測量該范圍的蛋白質(zhì)，并且在蛋白質(zhì)量僅為40μg時，吸光度值已接近2.5，反應(yīng)現(xiàn)象明顯，從側(cè)面反映該方法的靈敏度極高.在低蛋白質(zhì)量范圍內(nèi)(2～10μg)，線性關(guān)系方程式為y=0.07x-0.0216，R2=0.998，RSD<0.04，表明該方法在定量極微量蛋白質(zhì)時具有更大優(yōu)勢.72 h后再以含BSA為6和8μg的裂解液與上述茚三酮反應(yīng)液反應(yīng)，結(jié)果表明該改進方法的重復(fù)性高，同時說明該茚三酮反應(yīng)液穩(wěn)定性好，增強了以茚三酮定量蛋白質(zhì)方法的實用性.

圖3 牛血清白蛋白(BSA)標準曲線及重復(fù)性檢驗Fig.3 The standard curve of bovine serum albumin (BSA) and repeatability test

2.3 穩(wěn)定性檢驗

蛋白質(zhì)的回收率試驗結(jié)果如表1所示.由表1可知，本改進方法在測定時數(shù)據(jù)相對標準偏差均小于4%，蛋白質(zhì)回收率接近100%，說明該方法在測量時的穩(wěn)定性及精密度好.

表1 回收率試驗Table 1 Recovery experiments

甘氨酸對比試驗如表2所示.由表2可知，在短時間內(nèi)，蛋白質(zhì)在高溫高壓強堿性環(huán)境下裂解與未經(jīng)高溫高壓堿裂解對比，可以發(fā)現(xiàn)其裂解液的吸光度未有明顯改變，說明氨基酸中的氨基結(jié)構(gòu)未遭到破壞.由此可知，蛋白質(zhì)經(jīng)高溫高壓堿裂解后所釋放的游離氨基酸在此條件下依然能保持α-氨基結(jié)構(gòu)的完整性，從而保證了該方法在蛋白質(zhì)定量過程中的穩(wěn)定性.

表2 甘氨酸在高溫高壓強堿性水解液中的穩(wěn)定性Table 2 Stability of glycine in alkaline hydrolysis with high pressure and temperature

2.4 靈敏度與準確性分析

分別取BSA、溶菌酶(Lysozyme)、蛋白酶K(Proteinase K)和明膠(Geltin)，以本文改進的茚三酮法(IN)、茚三酮直接測定法(DN)和考馬斯亮藍染色法(CBB)做對比試驗，試驗結(jié)果如圖4所示.本文改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法在測定2～10μg蛋白質(zhì)的吸光度均較大，說明該法靈敏度高；且相同質(zhì)量不同種類蛋白質(zhì)的吸光度相近，說明該方法在蛋白質(zhì)定量時只與蛋白質(zhì)量有關(guān)，與種類基本無關(guān)；不同蛋白質(zhì)標準曲線的線性程度高(R2≥0.998)，線性直線近乎重疊，進一步說明該方法在測量蛋白質(zhì)時準確性好.而茚三酮直接測定法在蛋白質(zhì)量2～10μg 內(nèi)無法檢測到BSA、溶菌酶和明膠，說明茚三酮直接測定法的靈敏度極低，無法實現(xiàn)低濃度蛋白質(zhì)的定性和定量，但在定量蛋白酶K時吸光度較大，這很可能是由于該蛋白質(zhì)裸露的α-氨基含量明顯高于其他3種蛋白質(zhì).相比于其他兩種定量蛋白質(zhì)方法，考馬斯亮藍染色法顯示不同種類蛋白質(zhì)標準曲線的線性程度波動大(R2=0.951～0.998)，表明該方法的靈敏度與準確性均較差.

通過上述對比分析可知，采用本文所述改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法，其準確性與靈敏度明顯優(yōu)于茚三酮直接測定法和考馬斯亮藍染色法.

圖4 相同質(zhì)量不同種類蛋白質(zhì)分別采用改進的茚三酮法、茚三酮直接測定法與考馬斯亮藍法測定比較Fig.4 Comparison of four kinds of proteins measured by IN assay,DN assay and CBB assay

3 結(jié) 語

(1) 本文首次結(jié)合高溫堿裂解和以乙二醇為溶劑的反應(yīng)液的優(yōu)勢，對茚三酮定量蛋白質(zhì)法進行改進研究.采用該方法對茚三酮測定蛋白質(zhì)含量反應(yīng)過程中的關(guān)鍵參數(shù)進行了優(yōu)化研究，確定了相關(guān)最佳參數(shù)：測量波長為570nm、裂解時間為15min、顯色時間為15min和冷卻時間為5min.

(2) 基于該改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法，用BSA作為標準樣品制作標準曲線，在蛋白質(zhì)量僅為2～40μg即能實現(xiàn)準確定量，并在低蛋白質(zhì)量范圍內(nèi)(2～10μg)標準曲線方程為：y=0.07x-0.0216(R2=0.998，RSD<0.04).蛋白質(zhì)回收率試驗表明測量相對標準偏差為1.01%～3.39%和蛋白質(zhì)回收率為97.4%～100.5%，同時以甘氨酸為對象論證了該改進方法中的高溫高壓堿裂解在短時間內(nèi)對氨基酸中氨基結(jié)構(gòu)無影響.由此證明該方法在測定過程中具有較高重復(fù)性和穩(wěn)定性.

(3) 本文改進的茚三酮定量蛋白質(zhì)法，利用了茚三酮與氨基酸中氨基的高度靈敏反應(yīng)，雖在操作過程中將目標產(chǎn)物稀釋近8倍，但還能準確定量到2 μg蛋白質(zhì)，說明該方法在定量極微量蛋白質(zhì)上具有更大潛力，且不同種類蛋白質(zhì)的標準曲線線性程度高，且曲線近乎重合，從而說明本方法的靈敏性、準確度和適用性高.通過與茚三酮直接測定法和考馬斯亮藍染色法比較可知，本文改進的方法是一種更為靈敏、準確、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)定量方法，在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景.

[1] NAYUNI N K,CLOUTMAN-GREEN E,HOLLIS M,et al.Critical evaluation of ninhydrin for monitoring surgical instrument decontamination[J].Journal of Hospital Infection,2013,84(2):97-102.

[2] PERRETT D.From ‘protein’ to the beginnings of clinical proteomics[J].Proteomics-Clinical Applications,2007,1(8):720-738.

[3] WENRICH B R,TRUMBO T A.Interaction of nucleic acids with Coomassie Blue G-250in the Bradford assay[J].Analytical Biochemistry,2012,428(2):93-95.

[4] COMPTON S J,JONES C G.Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay[J].Analytical Biochemistry,1985,151(2):369-374.

[5] STARCHER B.A ninhydrin-based assay to quantitate the total protein content of tissue samples[J].Analytical Biochemistry,2001,292(1):125-129.

[7] ZHANG Y,FU Y,ZHOU S,et al.A straightforward ninhydrin-based method for collagenase activity and inhibitor screening of collagenase using spectrophotometer[J].Analytical Biochemistry,2013,437(1):46-48.

[8] SIDDIQUI F A,ARAYNE M S,SULTANA N,et al.Spectrophotometric determination of gabapentin in pharmaceutical formulations using ninhydrin and π-acceptors[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2010,45(7):2761-2767.

[9] HOSSEINIMEHR S J,POURMORAD F,MOSHTAGHI E,et al.Colorimetric determination of Baclofen with ninhydrin reagent and compare with HPLC method in tablet[J].Asian Journal of Chemistry,2010,22(1):522-526.

[10] MCGRATH R.Protein measurement by ninhydrin determination of amino acids released by alkaline hydrolysis[J].Analytical Biochemistry,1972,49(1):95-102.

[11] ABERNATHY D G,SPEDDING G,STARCHER B.Analysis of protein and total usable nitrogen in beer and wine using a microwell ninhydrin assay[J].Journal of the Institute of Brewing,2009,115(2):122-127.

[12] KANG S U,LUBEC G.Determination of in-gel protein concentration by a ninhydrin-based method[J].Proteomics,2011,11(3):481-484.

[13] BROOKS S P J,LAMPI B J,SARWAR G,et al.Acomparison of methods for determining total body protein[J]. Analytical Biochemistry,1995,226(1): 26-30.

[14] ROBERTS C W,BREWER J M,ALEXANDER J. Congenital toxoplasmosis in the Balb/c mouse: Prevention of vertical disease transmission and fetal death by vaccination[J]. Vaccine,1994,12(15): 1389-1394.

[15] MOSHA T C E,BENNINK M R.Microelement and amino acid profiles of cereal-bean-sardine composite supplementary foods for preschool-age children in tanzania[J]. Journal of Food Processing and Preservation,2011,35(1): 1-19.

[16] MOORE S,STEIN W H. Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids[J]. Journal of Biological Chemistry,1948,176(1): 367-388.

[17] SUN S W,LIN Y C,WENG Y M,et al. Efficiency improvements on ninhydrin method for amino acid quantification[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2006,19(2): 112-117.

[18] RAUL DELFINO M,MARIA MONZON C,DEL CARMEN TERESA SARNO M. Validation of ninhydrin quantitative method for cephalexin generic tablets[J]. Current Pharmaceutical Analysis,2013,9(1): 13-19.

[19] ALARFAJ A,RAZEQ A A,AL-QAHTANI N. Spectrophotometric determination of alendronate sodium in bulk drug and in pharmaceutical formulation[J]. Asian Journal of Chemistry,2011,23(2): 697-700.

[20] GARANYAN G S,KHANFERYAN R A,OGANESYAN E T. Chemical and biological investigation of hydrolysate based on lactic-acid bacterial cultures[J]. Pharmaceutical Chemistry Journal,2010,44(8): 459-462.

[21] KANG S U,HEO S,LUBEC G. In-gel total protein quantification using a ninhydrin-based method[J]. Amino Acids,2013,45(4): 1003-1013.

Improvement of Protein Determination by Ninhydrin Assay

ZHUWen-xiang,XIEXue-hui,FENGFan,LIUJian-she

(School of Environmental Science and Engineering,Donghua University,Shanghai 201620,China)

Alkaline hydrolyzed proteins in high temperature and ninhydrin reagent prepared in the ethylene glycol dissolving system were first combined with respective advantage.Several key parameters including measure wavelength,hydrolyzing time,colouration time and cooling time were optimized,which were 570nm,15min,15min and 5min,respectively.The high repeatability and stability of this Improved Ninhydrin (IN) assay was testified by the standard curve of BSA (Bovine Serum Albumin).Futhermore,it reveals that IN assay shows higher linear and sensitivity than Direct Ninhydrin and Coomassie Brilliant Blue assay.Therefore,the IN assay has great application prospects in the field of biology,chemistry and medicine owing to its sensitivity,accuracy and stability for determination of a variety of proteins.

ninhydrin; alkaline hydrolysis; ethylene glycol; Coomassie Brilliant Blue

1671-0444(2015)01-0060-05

2013-10-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(41073060);教育部博士點新教師基金資助項目(20120075120014);上海市自然科學(xué)基金青年資助項目(12ZR1440400);上海市重點學(xué)科建設(shè)資助項目(B604)

朱文祥(1989—)，男，江西鷹潭人，碩士研究生，研究方向為環(huán)境生物技術(shù).E-mail:zhuwenxiang2011@126.com柳建設(shè)(聯(lián)系人),男,教授,E-mail:liujianshe@dhu.edu.cn

Q 5-33；Q 530

A