IL-18的畢赤酵母表達(dá)及其激活NF-κB和p38途徑促進(jìn)　BRL-3A細(xì)胞增殖

張繼紅，　許曉亞，　楊剛剛，　馬誠(chéng)凱，　徐存拴（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院　組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南　新鄉(xiāng)453007；.河南省科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南　新鄉(xiāng)　453007）

IL-18的畢赤酵母表達(dá)及其激活NF-κB和p38途徑促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞增殖

張繼紅1，2，許曉亞2，楊剛剛2，馬誠(chéng)凱2，徐存拴2
（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)453007）

目的：探討白細(xì)胞介素18（IL-18）在畢赤酵母中的表達(dá)條件及其對(duì)BRL-3A細(xì)胞的增殖作用和作用機(jī)制.方法：構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-IL-18，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，PCR、Western blotting和SDS-PAGE方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物的正確性，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，再經(jīng)雙水相萃取偶聯(lián)DEAE離子交換層析分離純化表達(dá)產(chǎn)物.然后，MTT法檢測(cè)重組大鼠IL-18（rrIL-18）對(duì)BRL-3A細(xì)胞的增殖作用，RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)IL-18信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化.結(jié)果：在3 L發(fā)酵罐規(guī)模下600的菌體密度、pH＝6.0、誘導(dǎo)溫度23℃、體積分?jǐn)?shù)分別為20% DO和0.25%甲醇濃度條件下表達(dá)質(zhì)量濃度最高約為280 mg/L，經(jīng)分離純化后純度可達(dá)95%.此外，質(zhì)量濃度為15 ～20 ng/mL rrIL-18孵育48 h，能明顯促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞增殖（P＜0.5），且IL18R、MyD88、NF-κB及其下游靶蛋白cyclin B1和cyclin B2的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.5）.同時(shí)，p38途徑的ATF2及其下游靶蛋白cyclin A2和Bcl-2的表達(dá)量也隨之升高（P＜0.5）.結(jié)論：成功構(gòu)建大鼠IL-18表達(dá)載體，優(yōu)化在畢赤酵母中的發(fā)酵條件和純化工藝，并首次證實(shí)IL-18能通過(guò)NF-κB和p38/ATF2途徑激活細(xì)胞增殖相關(guān)靶蛋白cyclin B1、cyclin B2、cyclin A2和Bcl-2，進(jìn)而促進(jìn)BRL-3A大鼠肝細(xì)胞增殖.

白細(xì)胞介素18；畢赤酵母；雙水相萃取；細(xì)胞增殖；信號(hào)通路

白介素18（interleukin 18，IL-18）是1995年由Okamura等［1］從中毒性休克小鼠的干細(xì)胞中分離出來(lái).由于這種細(xì)胞具有較強(qiáng)的γ-干擾素誘生能力，因此，最初被命名為γ-干擾素誘生因子（interferon-γ-inducing factor，IGIF）.1996年，Ushio等［2］以小鼠IGIF為探針，從正常人肝臟cDNA文庫(kù)中克隆出人IGIF cDNA，并在大腸桿菌（E.coli）中表達(dá).大鼠IL-18前體蛋白由194個(gè)氨基酸組成，與人的IL-18在氨基酸和核苷酸水平上均有65%的同源性，含有一段由36個(gè)氨基酸組成的引導(dǎo)序列，其中不含N端糖基化位點(diǎn)和疏水性信號(hào)肽.成熟的IL-18為切除前導(dǎo)序列的多肽，由157個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為18～19 ku［1－3］.

研究表明，IL-18是一個(gè)多效性的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)作用.除能誘導(dǎo) Th1、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ外，在抗病原微生物感染、抗腫瘤免疫、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等方面均具有潛在的應(yīng)用前景［4］.本研究用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組大鼠IL-18（recombi-nant rat IL-18，rrIL-18），利用酵母偏好密碼子優(yōu)化基因序列和優(yōu)化發(fā)酵條件來(lái)提高目的蛋白表達(dá)量.同時(shí)采用雙水相萃取偶聯(lián)DEAE層析技術(shù)進(jìn)行純化，操作簡(jiǎn)便且能高效率地獲得高純度和高收率的目的蛋白.

IL-18主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在其他細(xì)胞、組織中也廣泛表達(dá)，如肝臟、小腸上皮、脾臟、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)等［5－6］.研究表明，IL-18作為一個(gè)細(xì)胞分裂原，能促進(jìn)多種類型的細(xì)胞增殖，如T細(xì)胞、軟骨和成骨細(xì)胞、生殖細(xì)胞、人黑色素細(xì)胞等［7－10］.本研究小組的前期研究結(jié)果也表明，IL-18在大鼠肝再生中促進(jìn)肝細(xì)胞增殖［11］，然而，其作用機(jī)制尚不清楚.因此，本研究以大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A為材料，對(duì)IL-18促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行探索性研究，為尋找有效的細(xì)胞因子加速肝切除術(shù)和肝移植后的肝再生、促進(jìn)肝病患者的肝功能恢復(fù)提供靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

E.coli DH5α菌株購(gòu)自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司；畢赤酵母GS115、pPIC9K載體、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Trizol購(gòu)自In-vitrogen公司；大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A購(gòu)自北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Pro-mega公司；噻唑藍(lán)（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-yl）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO）購(gòu)自 Sigma公司；一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；電化學(xué)發(fā)光液（electrochemiluminescence，ECL）購(gòu)自南京凱基生物公司；重組大鼠IL-18購(gòu)自R＆D system公司.

1.2方法

（1）基因合成與載體構(gòu)建根據(jù)大鼠IL-18基因序列（NM001562.3）和畢赤酵母密碼子偏好性，利用在線序列優(yōu)化工具對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)（http://www.evolvingcode.net），去除酵母通用信號(hào)肽α交配因子末端EAEA框，依據(jù)畢赤酵母密碼子的堿基使用頻率優(yōu)化密碼子組成并提高GC含量，優(yōu)化的序列全長(zhǎng)為749 bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.

（2）重組質(zhì)粒鑒定合成的IL-18經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切連接至pPIC9K載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞.重組質(zhì)粒pPIC9K-IL-18經(jīng)SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，在組氨酸缺陷型（MD）平板上進(jìn)行篩選.28℃培養(yǎng)3 d，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取酵母基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，并回收目的產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序.

挑選鑒定正確的菌株接種至10 mL YPG培養(yǎng)基，于28℃、250 r/min離心振蕩培養(yǎng)18～24 h，當(dāng)△A600為10時(shí)，按1∶100接種至100 mL BMGY培養(yǎng)基，于280 r/min離心繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入終體積分?jǐn)?shù)為1%（v/v）的甲醇于23℃、200 r/min條件下進(jìn)行誘導(dǎo).每12 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%發(fā)酵液體積（v/v）的甲醇.誘導(dǎo)5 d后，取1 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，上清液用TCA濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE.

（3）發(fā)酵條件優(yōu)化在1L搖瓶規(guī)模下，將篩選出的高表達(dá)菌株（△A600為10），按1∶100分別接種至不同pH（5.5、6.0、6.5）的100 mL BMGY培養(yǎng)基中，于300 r/min離心繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入終體積分?jǐn)?shù)為1%（v/v）的甲醇開(kāi)始誘導(dǎo).同時(shí)，設(shè)置不同的誘導(dǎo)溫度（20、23和26℃），期間，每12 h補(bǔ)加1次甲醇，轉(zhuǎn)速為200 r/min離心.誘導(dǎo)5 d后，取500 μL上清TCA后進(jìn)行SDS-PAGE.

在3 L發(fā)酵罐規(guī)模下，取△A600為10的表達(dá)菌株，按1∶100接種至200 mL YPG培養(yǎng)基中培養(yǎng)至△A600為20時(shí)，取200 mL菌液和1.5 mL PTM1加入含1.5 L BSM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的3.0 L發(fā)酵罐中，按搖瓶?jī)?yōu)化的最佳pH和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行，流加氨水和磷酸控制pH為6.0，調(diào)節(jié)通氣量控制溶氧（DO），按發(fā)酵罐初始培養(yǎng)條件培養(yǎng)，當(dāng)初始培養(yǎng)基甘油耗盡時(shí)按DO關(guān)聯(lián)進(jìn)行甘油補(bǔ)加，當(dāng)達(dá)到預(yù)定菌體密度時(shí)，饑餓1 h后開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)，每升甲醇含20 mL PTM2培養(yǎng)基，誘導(dǎo)溫度為 23℃.以rrIL-18表達(dá)量為指標(biāo)，對(duì)不同菌體密度、溶氧控制策略和甲醇濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化.誘導(dǎo)5 d后，取上清進(jìn)行SDS-PAGE.

（4）蛋白的分離純化取誘導(dǎo)5 d的發(fā)酵液，于4℃、4 000 g離心30 min，收集上清，每升上清中加入308 g K2HPO4，待完全溶解后再取247 mL無(wú)水乙醇緩慢加入攪拌體系中，將混合體系置于分液漏斗中－20℃過(guò)夜，形成上、中、下3層，上層分別經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾和10 ku膜包超濾后進(jìn)行DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱進(jìn)行純化.用濃度為10 mmol/L Na2HPO4（pH8.0）平衡柱子，取10 mg的樣品加入50 mL濃度為20 mmol/L的Tris溶液（pH＝8.8），以1 mL/min的流速流穿離子交換樹脂，然后分別用緩沖液（pH 8.8的濃度為20 mmol/L Tris-HCl）、洗脫液（濃度分別為20 mmol/L Tris＋25 mmol/L NaCl溶液）和高鹽（濃度分別為20 mmol/L Tris＋1 mol/L NaCl溶液）進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，收集各洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE.

（5）MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中.質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化分散細(xì)胞后，按3.0× 103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入200 μL含質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、15、20、40、80 ng/mL rrIL-18的培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度為5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品rrIL-18（R＆D system公司）為陽(yáng)性對(duì)照.繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔中加入MTT使其終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，于37℃避光孵育4 h，徹底棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，輕輕震蕩10 min，用Biotek reader酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光值.每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

（6）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)基因的表達(dá)變化細(xì)胞總RNA抽提按Trizol試劑操作說(shuō)明書進(jìn)行，分光光度計(jì)檢測(cè)其純度（A260/280吸光值），變性瓊脂糖凝膠電泳（70 V，20 min）檢測(cè)其完整性.然后，以2 μg RNA為模板，按照AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第1鏈cDNA.最后，取1 μL cDNA，加入10 μL SyBr GreenⅠMix、0.4 μL引物、8.6 μL無(wú)核酸酶純水.混勻后，放入Rotor-Gene 3000中擴(kuò)增基因，檢測(cè)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)值，并以β-actin（NM＿031144）為內(nèi)參計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（Ratio值）.每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.根據(jù)基因在GenBank登錄的序列號(hào)，用primer express 2.0軟件設(shè)計(jì)其相應(yīng)引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）.

表1　引物序列和擴(kuò)增條件Table 1　The primer sequence and PCR condition

（7）免疫印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá)變化蛋白免疫印跡按文獻(xiàn)［12］進(jìn)行.rrIL-18處理細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，12 000 g離心15 min，收集上清，經(jīng)蛋白濃度測(cè)定后，取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE，然后，用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜置于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液中37℃封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL底物發(fā)光法進(jìn)行顯色.最后，用圖像分析軟件Image QuantTMTL進(jìn)行灰度掃描和蛋白含量分析.

（8）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的單因素方差分析法分析組間差異，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2　結(jié)果

2.1rrIL-18的畢赤酵母表達(dá)

pPIC9K-IL-18重組質(zhì)粒經(jīng)SacI單酶切后的條帶大小約10 kb，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后得到的目的片段為749 bp，與預(yù)期結(jié)果相一致.用載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約900 bp的目的條帶.重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)IL-18序列定向插入到表達(dá)載體中，且未改變讀碼框架（圖1Ⅰ）.

將線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)涂板、培養(yǎng)、篩選等過(guò)程獲得單克隆菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取酵母基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物，挑取的轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出900 bp左右的特異性目的條帶（圖1Ⅱ），表明IL-18已成功整合至畢赤酵母基因組中.挑取鑒定正確的單克隆菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，5 d時(shí)取發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting，均在18.3 ku處檢測(cè)出目的條帶（圖1Ⅲ和Ⅳ）.

2.2rrIL-18的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.0 L搖瓶中誘導(dǎo)5 d，檢測(cè)不同pH和誘導(dǎo)度對(duì)rrIL-18的表達(dá)影響，結(jié)果顯示，在pH6.0和誘導(dǎo)溫度23℃條件下達(dá)到最高峰，表達(dá)質(zhì)量濃度約為25 mg/L（圖2Ⅰ）.3L發(fā)酵罐規(guī)模下，在溶氧為30%、甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.25%的條件下，起始誘導(dǎo)菌體的A600達(dá)到600時(shí)表達(dá)質(zhì)量濃度達(dá)到最高，約為255 mg/L（圖2Ⅱ）.在起始誘導(dǎo)密度相同、甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.25%的條件下，溶氧水平由5%逐漸提高至20%時(shí)，表達(dá)量逐漸提高，最高質(zhì)量濃度約為270 mg/L（圖2Ⅲ）.并且，在誘導(dǎo)過(guò)程中體積分?jǐn)?shù)為0.25%的甲醇下表達(dá)量最高，質(zhì)量濃度達(dá)到280 mg/L.隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌體的生長(zhǎng)也逐漸受到抑制，甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，蛋白質(zhì)量濃度表達(dá)量低至130 mg/L（圖2Ⅳ）.

2.3rrIL-18的分離純化

取誘導(dǎo)5 d發(fā)酵液，離心收集上清，用雙水相系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵液中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，rrIL-18主要集中在上層，而菌體和雜蛋白主要分布在中下層.取10 ku濃縮液進(jìn)行DEAE離子交換層析，收集各洗脫峰，rrIL-18主要分布在濃度分別為20 mmol/L Tris＋25 mmol/L NaCl洗脫液里，凝膠染色掃描后進(jìn)行半定量，其純度約為95%（圖3）.

圖1　重組質(zhì)?！PIC9K-IL-18和表達(dá)產(chǎn)物的鑒定Fig.1　Identification of recombinant plasmid pPIC9K-IL-18 and the expression product

圖2　不同發(fā)酵條件對(duì)　rrIL-18表達(dá)量的影響Fig.2　The affect of different fermentation conditions on the expression of rrIL-18

2.4rrIL-18對(duì)BRL-3A細(xì)胞的增殖作用

不同濃度的rrIL-18處理BRL-3A細(xì)胞后48 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明，濃度為10 ～20 ng/mL的rrIL-18處理組細(xì)胞活力顯著高于正常對(duì)照組（0 ng/mL）（P＜0.05），其中，濃度分別為15和20 ng/mL處理組與對(duì)正常對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01，圖4）.

圖3　SDS-PAGE分析分離純化的rrIL-18Fig.3　The detection of rrIL-18 after isolation and purification

圖4　不同質(zhì)量濃度的　rrIL-18對(duì)　BRL-3A細(xì)胞的增殖影響Fig.4　The effect on proliferation of BRL-3A cells by treatment with different concentration of rrIL-18

2.5IL-18信號(hào)通路相關(guān)基因和通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的表達(dá)

15ng/mL rrIL-18處理細(xì)胞后48 h，IL18R1的mRNA表達(dá)量增加，其蛋白水平也隨之明顯增加.NF-κB途徑的NF-κB1、MyD88和CCNB2的mRNA水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）.Western blot-ting結(jié)果表明，NF-κB表達(dá)上調(diào)，其上游的募集蛋白MyD88和其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin B1、cyclin B2的表達(dá)量也明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）.此外，p38/ATF途徑中，CCNA2和BCL-2在轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常對(duì)照組，其蛋白含量亦明顯升高（P＜0.05，圖5）.

圖5　IL-18信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)變化Fig.5　The expression change of genes/proteins associated with IL-18 signaling pathway

3　討論

畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本低，又具有真核生物的折疊和分泌機(jī)制，能實(shí)現(xiàn)蛋白酶解、折疊、糖基化等翻譯后修飾過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，且發(fā)酵工藝成熟，易放大生產(chǎn)規(guī)模.徐躍飛等［13］研究表明畢赤酵母系統(tǒng)可正確表達(dá)人IL-18，隨后，楊莉莉等［14］利用畢赤酵母表達(dá)出具有生物學(xué)活性的重組人IL-18，表達(dá)質(zhì)量濃度為202 mg/L.本研究構(gòu)建pPIC9K-IL-18載體并在畢赤酵母中成功表達(dá)出目的蛋白，進(jìn)一步對(duì)高表達(dá)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，3L發(fā)酵罐的rrIL-18質(zhì)量濃度可達(dá)280 mg/L，為搖瓶表達(dá)水平的11.2倍，比文獻(xiàn)［14］報(bào)道的表達(dá)量提高38.6%.隨后，本研究用雙水相系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行萃取，又經(jīng)DEAE離子交換層析進(jìn)一步純化，純度達(dá)95%，為深入研究IL-18的生物學(xué)功能提供了條件.

研究表明，多效性的細(xì)胞因子IL-18能刺激體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞增殖.Okamura等［15］發(fā)現(xiàn)，在有抗CD3分子單克隆抗體、刀豆蛋白A、IL-12的條件下，IL-18能刺激小鼠T細(xì)胞增殖.此外，IL-18作為一種細(xì)胞分裂原能促進(jìn)原代培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞和狗成骨細(xì)胞增殖［8］.另有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸中表達(dá)IL-18，且能促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖［9］.Zhou等［10］研究表明，質(zhì)量濃度為20 ng/mL的 IL-18能增強(qiáng)原代人黑色素細(xì)胞的增殖能力.Fix等［16］研究表明，質(zhì)量濃度100 ng/mL IL-18重組蛋白能促進(jìn)體外培養(yǎng)的原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖.本研究小組以前的研究結(jié)果也顯示，4 μg的注射劑量能促進(jìn)大鼠再生肝的肝細(xì)胞增殖［11］.本研究結(jié)果表明，rrIL-18在10 ～20 ng/mL質(zhì)量濃度下能促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞增殖，與以前的研究結(jié)果相一致.

IL-18的分子結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑類似于IL-1家族，通過(guò)其受體招募適配分子MyD88聚集IL-1相關(guān)激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子相關(guān)因子（TRAF-6），從而激活 NF-κB［17－18］.MyD88在IL-18信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用.在MyD88缺陷的Th1細(xì)胞中，IL-18誘導(dǎo)的NF-κB和JNK途徑也隨之被阻斷［19］.轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在機(jī)體內(nèi)普遍存在，能通過(guò)cyclin D1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)化；還能通過(guò)G2-M期的特異性基因CCNB1和CCNB2調(diào)節(jié)細(xì)胞的 G2-M期轉(zhuǎn)化［20－21］.本研究結(jié)果表明，rrIL-18處理BRL-3A細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其上游的招募蛋白MyD88、其下游調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin B1 和cyclin B2的表達(dá)量均明顯增加.因此，推論rrIL-18刺激BRL-3A細(xì)胞后NF-κB迅速被激活，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)其下游靶基因CCNB1和CCNB2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖.

另一方面，研究表明IL-18能通過(guò)促分裂原活化蛋白激酶MAPK激活轉(zhuǎn)錄因子ATF2［10，22］.Amin等［23］研究報(bào)道IL-18能增強(qiáng)人的滑膜成纖維細(xì)胞中ATF2的磷酸化.Breitwieser等［24］的研究結(jié)果顯示，肝臟發(fā)育過(guò)程中ATF2的抗凋亡作用主要是通過(guò)對(duì)p38激酶轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控.也有研究表明，ATF-2通過(guò)其細(xì)胞周期AMP效應(yīng)元件（cyclin AMP response el-emen，CRE）激活cyclin A2和Bcl-2啟動(dòng)子，增強(qiáng)其在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)［25－26］.Zhou等［10］研究表明，質(zhì)量濃度為20 ng/mL IL-18孵育原代人黑色素細(xì)胞24 h時(shí)，Bcl-2發(fā)生了有意義的表達(dá)上調(diào).本研究結(jié)果顯示，rrIL-18處理BRL-3A細(xì)胞后，ATF2及其下游靶蛋白cyclin A2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量均顯著升高.由此，推測(cè)IL-18同時(shí)激活了 p38/ATF2途徑，導(dǎo)致cyclin A2和Bcl-2的表達(dá)上調(diào).

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化了IL-18在畢赤酵母中高效表達(dá)的發(fā)酵條件和純化工藝，成功獲得純度較好的rrIL-18；并首次證實(shí)質(zhì)量濃度為15 ng/mL rrIL-18孵育BRL-3A大鼠肝細(xì)胞后，激活NF-κB和p38/ATF2途徑，并調(diào)節(jié)其下游細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因CC-NB1、CCNB2、CCNA2和BCL-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，其機(jī)制是否涉及蛋白磷酸化、siRNA干涉等方面，有待進(jìn)一步研究.

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［責(zé)任編輯：朱穎?］

Expression of interleukin-18 in Pichia pastoris and its effects on proliferation of BRL-3A cells via activation of NF-κB and p38 pathway

ZHANG Jihong1，2，XU Xiaoya2，YANG Ganggang2，MA Chengkai2，XU Cunshuan2
（1.Department of Histology and Embryology，School of Basic Medical Sciences，Xinxiang Medical University，Xinxiang，453007，China；2.State Key Laboratory Cultivation Base for Cell Differentiation Regulation，Xinxiang，453007，China）

Aim：To explore the expression conditions of rat interleukin-18（rIL-18）in Pichia pastoris and its effects and mechanism on proliferation of BRL-3A cells.Methods：pPIC9K-IL-18 expression vec-tor was constructed and then transformed to GS115 by electroporation.Expression level of the recombi-nant fusion protein was determined by PCR，SDS-PAGE and Western blotting.The induction conditions were optimized and the expression product was isolated and purified by the method of aqueous two-phase extraction coupled with DEAE ion exchange chromatography.The effect of the recombinant rat IL-18（rrIL-18）on rat liver cells was detected by MTT assay.The expression changes of IL-18-associated genes in the signaling pathway were determined by RT-PCR and Western blot.Results：Under the condi-tions of cell density at 600，pH＝6.0，23？C，20%dissolved oxygen（DO）and 0.25%methanol in a 3L bioreactor，and after it was induced for 5d，the highest expression level of rrIL-18 reached 280 mg/L.The purity of rrIL-18 was 95%after purification.It was found that rrIL-18 promoted proliferation of BRL-3A cells at the concentration of 15－20 ng/mL（P＜0.05）.Furthermore，at 48 h after treatment，IL-18 receptor increased at both mRNA and protein levels.The expression levels of transcription factor NF-κB，MyD88，and the downstream targets cyclin B1 and cyclin B2 were found remarkably increased.The tran-scription factor ATF2 of the p38 pathway and its targets cyclin A2 and Bcl-2 were also remarkably in-creased.Conclusion：Rat IL-18 expression vector was successfully constructed and the expression condi-tions and purification method were optimized in Pichia pastoris system.It was demonstrated for the first time that IL-18 can promote proliferation of BRL-3A cells via NF-κB and p38/ATF2 pathways by targe-ting cyclin B1，cyclin B2，cyclin A2 and Bcl-2.

interleukin-18；Pichia pastoris；aqueous two-phase extraction；cell proliferation；signaling pathway

Q291

A

1000－9965（2015）06－0458－09

10.11778/j.jdxb.2015.06.004

2015－03－02

國(guó)家973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)基金項(xiàng)目（2012CB722304）；河南省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（111100910600）

張繼紅（1976－），女，博士研究生，研究方向：真核基因的表達(dá)與調(diào)控

徐存拴（1958－），男，教授，博士生導(dǎo)師，Tel：0373－3328084；E-mail：cellkeylab＠126.com