大黃酚對(duì)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)的影響及其相關(guān)機(jī)制

薛占霞，高永山，沈麗霞，薛貴平（河北北方學(xué)院.藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，.附屬第一醫(yī)院心臟外科，河北張家口 075000）

大黃酚對(duì)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)的影響及其相關(guān)機(jī)制

薛占霞1，高永山2，沈麗霞1，薛貴平1
（河北北方學(xué)院1.藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，2.附屬第一醫(yī)院心臟外科，河北張家口 075000）

目的 探討大黃酚對(duì)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制。方法 原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞共分5組，分別同時(shí)加入氯化銨5 mmol·L-1+大黃酚0.1，1.0和10.0 mg·L-1（共3組），氯化銨5 mmol·L-1+細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）抑制劑UO126（10 μmol·L-1）組和氯化銨5 mmol·L-1+p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制劑SB239063（10 μmol·L-1）組，處理48 h。紫外分光法測定氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮合酶（NOS）的活性；Western蛋白印跡法檢測ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平，RT-PCR檢測c-fos和c-jun mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與氯化銨5 mmol·L-1相比，大黃酚1.0和10.0 mg·L-1顯著改善氨誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激，降低了MDA和NO的含量及NOS的活性（P＜0.05），明顯升高了GSH-Px和SOD的活性（P＜0.05）；大黃酚1.0和10.0 mg·L-1也明顯降低氨誘導(dǎo)ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化增加（P＜0.05）；大黃酚0.1，1.0 和10.0 mg·L-1，UO126和SB239063均可逆轉(zhuǎn)氨誘導(dǎo)c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)的作用（P＜0.05）。結(jié)論大黃酚通過抗氧化機(jī)制影響ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)氨誘導(dǎo)c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)。

大黃酚；星形細(xì)胞；氧化性應(yīng)激；絲裂原活化蛋白激酶

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.006

肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）是急、慢性肝功能衰竭引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主要臨床表現(xiàn)的一種嚴(yán)重綜合征，其病理改變主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞病變［1］。研究報(bào)道，慢性氨處理原代培養(yǎng)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，可引起細(xì)胞腫脹及對(duì)谷氨酸再攝取降低，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙［2］，而本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，氨5 mmol·L-1處理星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h，c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)。Fos家族成員可和Jun家族成員形成一組激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）蛋白二聚體［3］。AP-1在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、炎癥及其他病理過程中起著重要作用，且學(xué)習(xí)、記憶及神經(jīng)發(fā)育等均與AP-1蛋白表達(dá)有關(guān)。AP-1的活性與c-fos和c-jun基因表達(dá)密切相關(guān)。c-fos和c-jun的表達(dá)受多種因素調(diào)控［4］，包括第二信使（蛋白激酶C，鈣離子和環(huán)磷腺苷等）、興奮性氨基酸（谷氨酸）、某些藥物（乙酰膽堿，阿巴明和人參皂苷等）和有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路［5］。目前研究較多的是MAPK信號(hào)通路對(duì)c-fos和c-jun基因表達(dá)的影響，而MAPK磷酸化是氧化應(yīng)激的一個(gè)重要后續(xù)效應(yīng)［2］。MAPK包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2），p38 MAPK和JNK1/2/3。研究報(bào)道，氨5 mmol·L-1處理星形膠質(zhì)細(xì)胞1，3，6，12，24，48，72 h，ERK1/2的磷酸化在6 h處最高，12～24 h降低，48～72 h回升；p38 MAPK磷酸化在1 h處增加并長時(shí)維持此水平；JNK1/2/3磷酸化的峰值在3 h處，此后降低［2］。

研究表明，大黃酚（chrysophanol）對(duì)大鼠肝、腦組織過氧化脂質(zhì)（lipid peroxide，LPO）生成有顯著抑制作用；明顯升高腦中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，清除氧自由基，保護(hù)腦神經(jīng)元細(xì)胞膜［5］。但在細(xì)胞水平上探討大黃酚的抗氧化作用及對(duì)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道。本研究旨在探討大黃酚對(duì)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

氯化銨，規(guī)格：每瓶100 g，批號(hào)：A9434，購于美國Sigma公司；大黃酚（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110796-201017），制備大黃酚單體〔N，N-二甲基甲酰胺（DMF）∶吐溫80∶生理鹽水=1∶1∶8〕溶液。SOD檢測試劑盒、GSH-Px、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一抗包括總ERK1/2（批號(hào)：sc-94）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2，批號(hào)：sc-7383）、總p38 MAPK（批號(hào)：sc-166357）和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK，批號(hào)：sc-166182），二抗包括山羊抗兔IgG（批號(hào)：sc-45101）和山羊抗鼠IgG（批號(hào)：sc-395763）均購自美國Santa Cruz公司。UO126和SB239063均購買于德國Calbiochem公司；Trizol購買于美國Invitrogen公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0購自寶生物工程有限公司（中國大連）。PCR擴(kuò)增儀（Whatman Biometr，德國），低溫超速離心機(jī)（北京安亭儀器設(shè)備廠，中國）。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的制備［6］及分組

選擇新生1 d內(nèi)小鼠，取腦，去腦膜，機(jī)械分散腦細(xì)胞并過濾。用含10%馬血清培養(yǎng)液（g·L-1：DMEM 8.3，葡萄糖1，谷氨酰胺0.292，丙酮酸鈉0.11，碳酸氫鈉3.7，酚紅0.015）稀釋過濾后的細(xì)胞，分裝到60 mm培養(yǎng)皿中（每皿裝3 mL培養(yǎng)液），37℃，5%CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)（＞95%），每皿加入雙丁酰環(huán)化腺苷酸0.369 mg。

培養(yǎng)好的原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為正常細(xì)胞對(duì)照組、氯化銨5 mmol·L-1組、氯化銨5 mmol·L-1+大黃酚0.1，1.0和10.0 mg·L-1，氯化銨5 mmol·L-1+UO126 10 μmol·L-1和氯化銨5 mmol·L-1+SB239063 10 μmol·L-1組，處理48 h。

1.3 紫外分光法測定MDA、NO的含量和GSH-Px，SOD及NOS的活性

分別提取正常細(xì)胞對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的總蛋白，BCA法測蛋白濃度。按照說明書分別測定MDA及NO含量（mmol·g-1蛋白）和GSH-Px，SOD及NOS的活性（kU·g-1蛋白）。

1.4 Western蛋白印跡法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化

取制備的各處理組細(xì)胞總蛋白，每組50 mg，經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加1∶1000倍稀釋（ERK1/2，p-ERK1/2，p38 MAPK，p-p38 MAPK）一抗，室溫孵育2 h；TBS-T洗膜4次，每次8 min；加1∶3000倍稀釋的二抗，孵育2 h，TBS-T洗膜4次，每次10 min。使用ECL發(fā)光液曝光。采用Window AlphaEase TM FC 32-bit軟件進(jìn)行條帶吸光度值分析，以磷酸化的ERK1/2及p38 MAPK吸光度和總的ERK1/2 及p38 MAPK吸光度的比值表示ERK1/2及p38 MAPK磷酸化水平的指標(biāo)。

1.5 RT-PCR檢測原代星形膠質(zhì)細(xì)胞c-fos和c-jun mRNA表達(dá)的變化

分別提取正常細(xì)胞對(duì)照組和氨中毒組原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度測定RNA濃度，參考Xue等［7］RT-PCR法測定c-fos和c-jun mRNA的表達(dá)，以TATA盒式蛋白編碼基因（TATA-boxing protein，Tbp）為內(nèi)參。根據(jù)試劑盒說明書加入各反應(yīng)試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：30℃ 10 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃5 min；PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性40 s，60℃（c-fos）、57℃（c-jun）、55℃（Tbp）復(fù)性40 s，72℃延伸40 s，循環(huán)37次，72℃延伸加時(shí)10 min。反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳，F(xiàn)luorochem 5500成像系統(tǒng)采集圖像，以c-fos和c-jun mRNA吸光度和Tbp吸光度的比值表示c-fos和c-jun mRNA相對(duì)表達(dá)量。

c-fos，c-jun和 Tbp的引物如下：c-fos （forward：5′-ACCTAGCCGTGGAGCTTGG-3′，reverse：5′-GCCCTTGGTTGTTTACCTGG-3′，542 bp）［8］；c-jun（forward：5′-CCTTCTACGACGATGCCCTCAA-3′，reverse：5′-GGGGTCGGTGTAGTGGTGATGT-3′，228 bp）［9］；Tbp（forward：5′-CCACGGACAACTGCGTTGAT-3′；reverse：5′-GGCTCATAGCTACTGAACTG-3′，236 bp）［10］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大黃酚對(duì)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞MDA和NO的含量及NOS，GSH-Px及SOD活性的影響

表1結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞對(duì)照組比較，氯化銨5 mmol·L-1組星形膠質(zhì)細(xì)胞MDA和NO的含量及NOS活性升高（P＜0.05），同時(shí)GSH-Px和SOD活性降低（P＜0.05），說明高濃度氨導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激；與氯化銨5 mmol·L-1組相比，大黃酚0.1 mg·L-1組，氧化應(yīng)激各指標(biāo)無明顯變化；大黃酚1.0和10.0 mg·L-1組MDA、NO含量及NOS活性顯著降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性明顯升高（P＜0.05），提示在細(xì)胞水平，大黃酚具有抗氧化作用。

Tab.1 Effect of chrysophanol on oxidative stress indicators in mouse astrocytes exposed to NH4Cl

2.2 大黃酚降低氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2 和p38 MAPK的磷酸化

圖1結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞對(duì)照組比較，氯化銨5 mmol·L-1組ERK1，ERK2和p38 MAPK的磷酸化水平分別增加了143%，147%和139%（P＜0.05）；與氯化銨5mmol·L-1組比較，大黃酚1.0和10.0mg·L-1實(shí)驗(yàn)組ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），大黃酚0.1 mg·L-1組不能逆轉(zhuǎn)氯化銨誘導(dǎo)ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平升高。

2.3 大黃酚，UO126和SB239063逆轉(zhuǎn)氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞c-fos和c-jun mRNA的表達(dá)水平

圖2結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞對(duì)照組比較，氯化銨5 mmol·L-1組，c-fos和c-jun mRNA表達(dá)分別顯著下調(diào)了84%和68%（P＜0.05）；與氯化銨5 mmol·L-1組比較，大黃酚0.1，1.0，10 mg·L-1，UO126和SB239063組c-fos mRNA表達(dá)分別上調(diào)了69%，81%，80%，80%和70%（P＜0.05），c-jun mRNA表達(dá)分別上調(diào)了50%，66%，64%，67%和50%（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of chrysophanol on ERK1/2（B，C）and p38 MAPK（D）phosphorylation in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.1：normal cell control；2：NH4Cl 5 mmol·L-1；3-5：NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10 mg·L-1.B，C and D were the semiquantitative results of A.±s，n=5.*P＜0.05，compared with normal cell control group；#P＜0.05，compared with NH4Cl group.

Fig.2 Effect of chrysophanol，UO126 and SB239063 on c-fos（B）and c-jun（C）mRNA expression in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by RT-PCR.See Tab.1 for the cell treatment.1：normal cell control；2：NH4Cl 5 mmol·L-1；3-5：NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10 mg·L-1；6：NH4Cl 5 mmol·L-1+UO126 10 mmol·L-1；7：NH4Cl 5 mmol·L-1+ SB239063 10 mmol·L-1.B，C were the semiquantitative results of A.±s，n=5.*P＜0.05，compared with normal cell control group；#P＜0.05，compared with NH4Cl group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，大黃酚可消除氨誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激，并進(jìn)一步抑制ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平的升高，從而逆轉(zhuǎn)氨誘導(dǎo)c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)的作用。提示大黃酚可通過抗氧化應(yīng)激的機(jī)制影響并保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。但大黃酚作為大分子量有機(jī)物，不易通過細(xì)胞膜，推測大黃酚主要通過抑制擴(kuò)散到細(xì)胞外的超氧自由基而起到抗氧化作用。

研究報(bào)道，c-fos和c-jun基因表達(dá)與MAPK磷酸化水平呈正相關(guān)［11］。但本課題研究發(fā)現(xiàn)，慢性高濃度氨處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平升高，但c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)，提示c-fos和c-jun mRNA表達(dá)亦受其他因素調(diào)控。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體激動(dòng)劑可誘導(dǎo)紋狀體c-fos基因表達(dá)［3］。急性或慢性氨中毒均可影響NMDA受體的表達(dá)。在急性大劑量氨中毒大鼠模型的大腦皮質(zhì)、海馬、小腦等區(qū)域，NMDA受體被活化［12］，但大鼠慢性氨中毒，海馬區(qū)NMDA受體功能下降［13］。結(jié)合本課題現(xiàn)有研究結(jié)果推測星形膠質(zhì)細(xì)胞慢性氨中毒，NMDA受體功能下降，導(dǎo)致c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)，且NMDA受體功能的改變可能受MAPK信號(hào)通路調(diào)控。因此大黃酚逆轉(zhuǎn)氨誘導(dǎo)c-fos和c-jun mRNA表達(dá)下調(diào)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（來稿日期：2015-05-21接受日期：2015-11-17）

（本文編輯：賀云霞）

Effect of chrysophanol on down-regulated expression of c-fos and c-jun mRNA in mouse astrocytesexposed to ammonia and related mechanisms

XUE Zhan-xia1，GAO Yong-shan2，SHEN Li-xia1，XUE Gui-ping1
（1.Department of Pharmacology，2.The First Affiliated Hospital Cardiac Surgery，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTlVE To investigate the effect and mechanisms of chrysophanol on the expression of c-fos and c-jun mRNA induced by ammonia chloride（NH4Cl）in mouse astrocytes.METHODS Primary mouse astrocytes were cultured with NH4Cl 5 mmol·L-1+chrysophanol 0.1，1.0 or 10.0 mg·L-1，or NH4Cl 5 mmol·L-1+extracellular regulated kinase1/2（ERK1/2）inhibitor UO126 10 mmol·L-1and NH4Cl 5 mmol·L-1+p38 mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK）inhibitor SB239063 10 mmol·L-1for 48 h. The levels of glutathione peroxidase（GSH-Px），superoxide dismutase（SOD），malondaldehyde（MDA），nitric oxide（NO）and nitric oxide synthase（NOS）were detected by UV spectrophotometry.The phosphorylation levels of ERK1/2 and p38 MAPK were detected by Western blotting.The expression of c-fos and c-jun mRNA was detected by RT-PCR.RESULTS Compared with NH4Cl 5 mmol·L-1group，ammonia-induced astrocytes oxidative stress was improved by chrysophanol（1.0 and 10.0 mg·L-1）. The content of MDA and NO and the activity of NOS were reduced（P＜0.05）.The activity GSH-Px and SOD was increased（P＜0.05）.The phosphorylation level of ERK1/2and p38 MAPK induced by ammonia was reduced in chrysophanol groups（P＜0.05）.Ammonia-induced c-fos and c-jun mRNA expression downregulation was reversed by chrysophanol（0.1，1.0 and 10.0 mg·L-1）and UO126 and SB239063（P＜0.05）.CONCLUSlON Chrysophanol may improve the downregulated expresion of c-fos and c-jun mRNA in mouse astrocytes exposed to NH4Cl by anti-oxidative stress by inhibiting the ERK1/2 and p38 MAPK phosphorylation.

chrysophanol；astrocyte；oxidative stress；MAP kinase

The project supported by Outstanding Youth Fund of Bureau of Education in Hebei Province （Y2012002）；and Natural Science Foundation of Hebei Province（H2012405016）

SHEN Li-xia，E-mail：shenlixiacn@sina.com，Tel：13932328109

R285，R966

A

1000-3002（2015）06-0912-05

河北省教育廳優(yōu)秀青年基金資助項(xiàng)目（Y2012002）；河北省自然基金資助項(xiàng)目（H2012405016）

薛占霞，女，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究，E-mail：xuezhanxia412@163.com，Tel：18931311063

沈麗霞，E-mail：shenlixiacn@sina.com，Tel：13932328109