谷氨酰胺對肝硬化患者Treg細(xì)胞的影響及其臨床意義研究

龔建娥，方云斌，湯維新

0 引言

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，其致病機(jī)制目前仍不清楚，其中涉及多種因素，近年來免疫系統(tǒng)的紊亂逐漸引起了學(xué)者們的關(guān)注，并成為研究熱點(diǎn)［1］。肝硬化門脈高壓時(shí)胃腸淤血，損傷黏膜屏障，菌群易位，大量內(nèi)毒素入血，進(jìn)一步加重炎性介質(zhì)的釋放，破壞機(jī)體的免疫防御能力，加重肝臟纖維化［2］，可見肝硬化患者黏膜屏障功能減弱也是引起患者免疫系統(tǒng)紊亂的主要機(jī)制之一。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，在機(jī)體的免疫平衡維持中發(fā)揮重要作用［3］。谷氨酰胺(Glutamin)是一種條件必需氨基酸，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示其可以維持大鼠腸黏膜完整性，抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫能力［4］。本研究觀察谷氨酰胺對肝硬化患者Treg細(xì)胞的影響及其腸黏膜保護(hù)功能，并探討其相關(guān)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床病例資料 收集2013年1月至2014年2月我院收治的肝硬化患者62例，肝硬化診斷符合2009美國肝硬化指南。排除標(biāo)準(zhǔn):心、腦、肺、腎等臟器嚴(yán)重障礙，惡性腫瘤，并發(fā)其他免疫、內(nèi)分泌和結(jié)締組織疾病。62例患者隨機(jī)分為常規(guī)治療組(對照組)和谷氨酰胺治療組(觀察組)，每組31例。對照組:男18例，女13例，年齡34～72歲，平均年齡(54.7±8.4)歲，病程3～8年，平均病程(5.2±1.4)年，Child-Pugh評分A級9例，B級14例，C級8例;觀察組:男19例，女12例，年齡33～71歲，平均年齡(53.2±8.6)歲，病程3～9年，平均病程(5.4±1.6)年，Child-Pugh評分A級8例，B級15例，C級8例。兩組患者的性別、年齡、病程、Child-Pugh評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。另取我院健康體檢者30例作為正常對照組，其中男16例，女14例，年齡32～71歲，平均年齡(52.8±8.8)歲，正常對照組患者和肝硬化患者在性別、年齡方面比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 治療方法 對照組:進(jìn)行常規(guī)的保肝治療、營養(yǎng)支持、并發(fā)癥處理等。觀察組:在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用谷氨酰胺(廣東嶺南制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字:H20051670)，3次/d，每次餐前30 min服用1小袋。4周為1個(gè)療程，2個(gè)療程后評定效果。

1.3 Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測 取受試者外周靜脈血5 mL，裂解紅細(xì)胞，1 500 g×20 min，去上清，留取單個(gè)核細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，400 μL懸浮液中加入 FITC-CD25和 APCCD4抗體(美國RD公司產(chǎn)品)各10 μL，避光孵育30 min。使用美國B-D公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測CD25和CD4雙陽性的Treg細(xì)胞。

1.4 白介素-10(IL-10)、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸表達(dá)的檢測 IL-10、DAO、D-乳酸表達(dá)的檢測使用ELISA法，檢測試劑盒購自上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，對照標(biāo)準(zhǔn)品使用日立HICTHI-7080全自動(dòng)生化分析儀檢測IL-10、DAO、D-乳酸表達(dá)水平的改變。

1.5 肝功能的檢測 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)交由檢驗(yàn)科，使用全生化分析儀測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較應(yīng)用 χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 谷氨酰胺對肝硬化患者外周血Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的影響 治療前，兩個(gè)治療組的Treg細(xì)胞比例、IL-10表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療后，兩組的Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)均升高(P＜0.05)，且觀察組升高的幅度高于對照組(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 谷氨酰胺對Treg細(xì)胞和IL-10表達(dá)的影響

2.2 谷氨酰胺對肝硬化患者DAO、D-乳酸表達(dá)的影響 見表2。由表2可見，治療前，兩個(gè)治療組的DAO、D-乳酸表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療后，兩組DAO和D-乳酸表達(dá)均降低(P＜0.05，P＜0.01)，且觀察組降低的幅度高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 谷氨酰胺對DAO和D-乳酸表達(dá)比較的影響

2.3 谷氨酰胺對肝硬化患者肝功能的影響 見表3。由表3可見，治療前，兩個(gè)治療組的ALT和AST表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);治療后，兩組ALT和AST表達(dá)均降低(P＜0.05，P＜0.01)，且觀察組降低的幅度高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 谷氨酰胺對肝硬化患者ALT、AST表達(dá)的影響

3 討論

Treg細(xì)胞是人體內(nèi)可抑制炎癥反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群，IL-10是Tregs細(xì)胞分泌的主要免疫抑制效應(yīng)因子［5-6］。本研究檢測結(jié)果顯示，肝硬化患者Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)均顯著低于正常對照人群，說明肝硬化患者處于一種高免疫反應(yīng)狀態(tài)，與何文敏等［2］和 Yu 等［7］的報(bào)道一致;而經(jīng)過治療后Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)顯著升高，說明這種高免疫反應(yīng)狀態(tài)可以得到糾正。谷氨酰胺是人體細(xì)胞能源代謝的一種主要氨基酸，為機(jī)體分化和細(xì)胞增殖提供重要能量，是重要的抗氧化劑—谷胱甘肽的前體物質(zhì)，對機(jī)體抗氧化、氧自由基的清除和免疫功能調(diào)節(jié)有積極意義［8］。本研究結(jié)果顯示，谷氨酰胺治療組Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)升高的幅度高于對照組，說明其對Treg細(xì)胞紊亂的糾正作用較好。

DAO是一種活性較高的細(xì)胞內(nèi)酶，95%以上存在于腸黏膜細(xì)胞中，腸黏膜受損、完整性破壞時(shí)，DAO釋放入血［9］。因此，血液DAO升高可反映腸黏膜損傷。D-乳酸是腸道內(nèi)固有細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，腸黏膜完整性破壞、通透性增加時(shí)，D-乳酸通過損傷的腸黏膜進(jìn)入血液［10］。綜上，血液DAO和D-乳酸水平的改變可以判斷腸黏膜通透性的變化及受損程度。本研究結(jié)果顯示，肝硬化患者血液DAO和D-乳酸水平均高于正常對照人群，說明肝硬化患者腸屏障的完整性受到破壞，經(jīng)過積極治療后，DAO和D-乳酸水平顯著降低，說明腸損傷得到了一定的恢復(fù)。同時(shí)，觀察組DAO和D-乳酸降低的幅度高于對照組，說明谷氨酰胺對腸黏膜屏障的保護(hù)作用較好。腸黏膜屏障的修復(fù)有利于阻止腸道內(nèi)有害物質(zhì)和病原體進(jìn)入機(jī)體而進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞。觀察組ALT和AST表達(dá)降低的幅度亦高于對照組，說用常規(guī)治療加上谷氨酰胺有利于肝硬化患者肝功能的恢復(fù)。谷氨酰胺在臨床使用中的不良反應(yīng)輕微，僅有個(gè)別惡心、便秘、腹瀉的報(bào)道［11］，本研究中未見上述不良反應(yīng)的發(fā)生，說明谷氨酰胺是一種安全的治療方法。

綜上所述，谷氨酰胺可以升高肝硬化患者Treg細(xì)胞比例和IL-10表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫紊亂狀態(tài)，有利于腸黏膜損傷的修復(fù)和肝功能的恢復(fù)，值得臨床借鑒采用。

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