原花青素對人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

李 燦，江 波，李瑞生，張文靜

0 引言

骨肉瘤是常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，預(yù)后較差。骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程非常復(fù)雜，受多種因素的影響［1］。放療及新輔助化療的應(yīng)用，可有效殺傷腫瘤細(xì)胞，提高患者的生存率，然而，很多患者在使用高劑量、高強(qiáng)度的化療藥物后，可導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)，并產(chǎn)生耐藥［2］。因此，尋找不良反應(yīng)低、骨肉瘤細(xì)胞耐藥性較低的藥物十分必要。

天然藥物以其療效確切、毒性低和不良反應(yīng)少，受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。原花青素(Procyanidins，PC)是由兒茶素、表兒茶素以C4-C8位或C4-C6位C-C鍵聚合而成，或C2-C7或C2-C5之間以醚鍵C-O-C結(jié)合的多酚類化合物，廣泛存在于自然界［3］，因其在酸性介質(zhì)中加熱后均可得到花青素(Cyanidins)而得名。研究證明，原花青素對皮膚癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病等都有抗腫瘤作用［4-6］。而且原花青素只對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，對正常細(xì)胞有促進(jìn)生長及存活的作用。筆者研究原花青素對人骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并從誘導(dǎo)凋亡、凋亡通路及氧化還原系統(tǒng)方面研究其抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥物及儀器 人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。原花青素購于天津尖峰天然產(chǎn)物公司，以1640培養(yǎng)液溶解配制成儲備原液。MTT和胰蛋白酶(Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司);順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司);Caspase-9、Caspase-12、Survivin酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(GDB公司);ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司);CO2孵箱(JOUAN公司);流式細(xì)胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于本研究。

1.2.2 MTT法檢測原花青素對Saos-2增殖的抑制作用 采用常規(guī)MTT法檢測腫瘤細(xì)胞株對藥物的敏感性。取對數(shù)生長期的Saos-2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，以 100 μL/孔接種于 96 孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分組:給藥組加入不同濃度的 PC(終濃度分別為 10、20、40、80、160、320 μg/mL)，陽性對照組加入順鉑(25 μg/mL)，陰性對照組加入1640培養(yǎng)液，每孔100 μL，每組均設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h及72 h，分別于終止培養(yǎng)前4 h加入 MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100 μL終止反應(yīng)，避光振蕩使充分溶解，用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定各孔吸光度值(A)。計算細(xì)胞抑制率，公式:(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的Saos-2細(xì)胞常規(guī)消化洗滌后，在5%CO2、飽和濕度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 PI染色法檢測原花青素對Saos-2細(xì)胞的凋亡率 取對數(shù)生長期Saos-2細(xì)胞常規(guī)消化洗滌后，在5%CO2、飽和濕度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的PC(終濃度分別為40、80、160 μg/mL)和陽性對照藥順鉑(40 μg/mL)。對照組加入等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置-20℃環(huán)境待測相關(guān)基因蛋白。收集細(xì)胞，于1 500 r/min、8 min離心洗滌2遍，用75%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，置4℃環(huán)境中過夜。檢測前預(yù)冷PBS溶液洗滌2遍，加PI緩沖液400 μL/管，避光染色30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平，以上實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA 法檢測 Caspase-9、Caspase-12、Survivin含量 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測凋亡相關(guān)基因蛋白。取“1.2.4”項下凍存的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第 1 孔加標(biāo)準(zhǔn)品 100 μL，混勻后吸出100 μL移至第2孔。如此反復(fù)對倍稀釋至第7孔，從第7孔吸出100 μL棄去，第8孔為空白對照。待測樣品孔加入培養(yǎng)上清100 μL，將板置37℃反應(yīng)120 min。用洗滌液將反應(yīng)板洗滌4～6次，吸水紙拍干。每孔加入第一抗體工作液100 μL，充分混勻后反應(yīng)60 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌，加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，反應(yīng)60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL后反應(yīng)5～10 min，最后加入50 μL終止液混勻，于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測吸光度，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算Caspase-9、Caspase-12和Survivin的含量。

1.2.6 Bradford法檢測PC對 Saos-2細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA含量的影響 取對數(shù)生長期的Saos-2細(xì)胞，常規(guī)消化洗滌后，向各組細(xì)胞沉淀中加入等量裂解液，冰上孵育10 min，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，并分別按照SOD和MDA試劑盒說明書進(jìn)行含量測定。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料的描述以±s表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗;多組資料間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC對Saos-2細(xì)胞增殖的抑制作用 PC在培養(yǎng)48、72 h后，均對Saos-2細(xì)胞的體外增殖有抑制作用，并具有濃度和時間依賴性，各濃度組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，見表1。

表1 PC對Saos-2細(xì)胞生長的抑制作用(n=6)

2.2 對Saos-2細(xì)胞生長狀況的影響 由圖1可見，對照組細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞密度高，經(jīng)PC作用后的Saos-2細(xì)胞，其增殖明顯受到抑制，細(xì)胞排列稀疏，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞密度逐漸減少。

圖1 PC對Saos-2細(xì)胞生長狀況的影響

2.3 PC對Saos-2細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度的PC均能明顯誘導(dǎo) Saos-2細(xì)胞凋亡，40、80、160 μg/mL濃度的PC作用于Saos-2細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別為18.19%、25.15%、30.02%，明顯高于對照組，隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡率增加，見表2。

表2 PC對Saos-2細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

2.4 PC對 Saos-2細(xì)胞 Caspase-9、Caspase-12和Survivin蛋白表達(dá)的影響 PC各劑量組Caspase-9和Caspase-12蛋白表達(dá)均高于細(xì)胞對照組(P＜0.05或P＜0.01)，均以中劑量組的效果最好;各劑量組Survivin蛋白表達(dá)明顯低于細(xì)胞對照組(P＜0.01)，具有劑量依賴性，見表3。

表3 PC對Saos-2細(xì)胞Caspase-9、Caspase-12和Survivin蛋白表達(dá)的影響

2.5 PC對Saos-2細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響 3個劑量的PC分別作用于Saos-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)SOD的活性與細(xì)胞對照組相比明顯升高(P＜0.05)，MDA的含量明顯降低(P＜0.01或 P＜0.05);順鉑組降低 SOD含量 P＜0.05，見表4。

表4 PC對Saos-2細(xì)胞SOD活性和MDA含量的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育和自身穩(wěn)定的重要機(jī)制，目前臨床上大多數(shù)藥物都能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到抗腫瘤的目的，因此，腫瘤防治的關(guān)鍵是抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7-9］。本研究結(jié)果顯示，通過MTT抗腫瘤實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，PC具有較強(qiáng)的體外抗人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的作用。對人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞生長的抑制具有劑量和時間依賴性。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑［10］。根據(jù)通路中的起始Caspase蛋白不同，細(xì)胞凋亡途徑又可分為:①死亡受體通路;②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;③線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體通路由Bcl-2家族成員在接受到胞內(nèi)的死亡信號后激活。這些Bcl-2家族成員與另外的Bcl-2家族成員作用，引起線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素 C(Cytc)和其他蛋白［11-12］。在ATP/dATP存在的情況下，Cytc與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)形成多聚復(fù)合體，通過Apaf-1氨基端的Caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)募集胞質(zhì)中的Caspase-9前體，并使其自我剪切活化并啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡［13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的主要場所，同時也是Ca2+的主要儲存庫。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡的破壞或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的過量積累都會誘導(dǎo)其表達(dá)，同時也導(dǎo)致胞質(zhì)的Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。Caspase-7激活 Caspase-12，激活的Caspase-12可進(jìn)一步剪切Caspase-3而引發(fā)細(xì)胞凋亡［14］。死亡受體通路中胞外的死亡信號可通過死亡受體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)。死亡配體與死亡受體激活Caspase-8，降低線粒體內(nèi)膜電位，導(dǎo)致Cytc的釋放［15］，后者可與 Apaf-1結(jié)合，在 dATP的存在下活化Caspase-9，后者能激活下游效應(yīng)Caspase，引起細(xì)胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白，可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的增殖和生長，可通過與Caspase-9結(jié)合而抑制Caspase系統(tǒng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Survivin下調(diào)Survivin基因表達(dá)水平可以降低腫瘤細(xì)胞凋亡的閾值，并且其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性［16-18］。3條凋亡通路最后都有Caspase的激活，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和保護(hù)成分的蛋白水解，發(fā)生細(xì)胞凋亡，說明Caspase是諸多調(diào)控通路的關(guān)鍵。

本研究顯示，PC在誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞凋亡的同時，基因蛋白Caspase-9和Caspase-12表達(dá)顯著增加，Survivin蛋白表達(dá)顯著減少，提示該細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)途徑與Caspase有關(guān)，可能與死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡這3條通路皆有關(guān)系。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，脂質(zhì)過氧化物(LOOH)形成的環(huán)狀過氧化物可斷裂形成烯醛、丙二醛，其含量間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度。脂質(zhì)過氧化越活躍，生成的MDA越多。SOD是一種重要的抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基而保護(hù)細(xì)胞和基質(zhì)免受氧自由基的損傷，是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中的第一道防線。本研究檢測了細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD和MDA的含量，結(jié)果表明，3個劑量的PC均能降低Saos-2細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，升高SOD的含量。提示PC的抗腫瘤作用機(jī)制可能與清除自由基有一定關(guān)系。

綜上所述，PC可抑制Saos-2細(xì)胞的增殖，這可能與其增加細(xì)胞內(nèi)SOD含量，降低MDA含量，從而增加機(jī)體的抗氧化功能有關(guān);另外，PC可影響Caspase-9、Caspase-12和 Survivin的表達(dá)，還提示其可能通過啟動死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、線粒體通路這三條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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