蘇云金芽胞桿菌6618殺蟲菌株的分離和鑒定*

張　晨，黃　菲，陸秀青，謝俊雁，丁學(xué)知，夏立秋，孫運(yùn)軍

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410081）

蘇云金芽胞桿菌6618殺蟲菌株的分離和鑒定*

張晨，黃菲，陸秀青，謝俊雁，丁學(xué)知，夏立秋，孫運(yùn)軍*

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410081）

從我國不同地區(qū)采集118份土樣，利用溫度篩選法分離獲得一株蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）6618，鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)該菌株能產(chǎn)生典型的菱形晶體，PCR分析表明其含有cry1類殺蟲基因。采用SDS-PAGE和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)該菌株主要產(chǎn)生130 kD原毒素，其組分由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素組成?；蛐蛄蟹治霰砻髟摼甑腸ry1Ac基因?yàn)橐阎腸ry1Ac1，而cry1Ae為新型殺蟲基因。毒力生測(cè)表明該菌株對(duì)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）幼蟲具有顯著的殺蟲效果。篩選獲得的高毒力Bt菌株6618為豐富我國蘇云金芽胞桿菌儲(chǔ)備和研發(fā)新型高效生物殺蟲劑提供了菌株資源。

蘇云金芽胞桿菌；菌株篩選；cry基因；質(zhì)譜分析；殺蟲活性

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.013

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）具有高效特異的殺蟲活性和環(huán)境安全性，目前已發(fā)展為世界上產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，在害蟲的綜合治理中具有非常重要的作用。Bt菌株在土壤、蟲尸和植物葉片等介質(zhì)中具有非常廣泛的分布［1，2］。隨著Bt殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，其存在的問題也逐漸表現(xiàn)出來，例如殺蟲譜較窄、成本較高以及誘發(fā)害蟲抗性等問題。因此篩選新型Bt菌株和發(fā)掘新的殺蟲基因，對(duì)擴(kuò)大Bt殺蟲譜及延緩害蟲抗性的產(chǎn)生具有非常重要的意義。

土壤是蘇云金芽胞桿菌生存的良好介質(zhì)。由于土壤生態(tài)環(huán)境的多樣性，土壤的類型、pH值、腐殖質(zhì)等特性的不同，都會(huì)影響B(tài)t菌株的分離效率率。目前經(jīng)常使用的分離方法主要有［3-6］:溫度篩選法、醋酸鈉選擇性篩選法、抗生素選擇性篩選法、醋酸鈉-抗生素篩選法。此外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的Bt殺蟲晶體蛋白基因得到鑒定，目前殺蟲基因鑒定方法主要有PCR-RFLP鑒定法、簡(jiǎn)并引物鑒定法、多重PCR鑒定法、Exclusive PCR鑒定法、分子雜交鑒定法等［7-10］。研究發(fā)現(xiàn)，cry基因類型不同，其編碼的殺蟲晶體蛋白對(duì)不同種類昆蟲的殺蟲活性也會(huì)不同［11］。cry1、cry2、cry9基因編碼的毒素蛋白一般對(duì)鱗翅目害蟲具有特異殺蟲活性；cry3、cry7、cry8、cry18基因編碼的毒素蛋白通常對(duì)鞘翅目害蟲有特異毒性；cry2、cry4、cry10、cry11基因能編碼對(duì)雙翅目害蟲有特異毒性的毒素蛋白；另外，對(duì)線蟲有活性的特異性毒素通常由cry5、cry6、cry12基因編碼。本研究利用溫度篩選法，從土壤中篩選分離Bt新菌株，并對(duì)其殺蟲活性及殺蟲基因進(jìn)行分析。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 用到的培養(yǎng)基如下: BPA培養(yǎng)基（牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，乙酸鈉3.4%，pH7.2-7.4）、BP培養(yǎng)基（牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂2%）、LB培養(yǎng)基（酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，胰蛋白胨1%）、GYS培養(yǎng)基（（NH4）2SO40.2%，酵母提取物0.2%，K2HPO40.05%，葡萄糖0.1%，CaCl20.008%，MnSO40.005%，MgSO40.02%）。蘇云金芽胞桿菌培養(yǎng)溫度為30℃，大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37℃。

1.1.2試劑、抗生素及使用濃度 PCR相關(guān)試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，其它生化試劑購自中國國藥集團(tuán)。PCR引物合成與基因測(cè)序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。氨芐青霉素購自Sigma公司，使用終濃度為100 μg/mL。

1.2方法

1.2.1蘇云金芽胞桿菌的分離篩選 將塊狀土樣粉碎均勻，稱重1 g加入100 mL無菌水中溶解，強(qiáng)烈振蕩5 min使土壤中的菌體充分釋放出來。取1 mL上層懸浮液原液，通過加入無菌水進(jìn)行梯度稀釋，使原液稀釋至10-3至10-7。取各稀釋度的樣品液0.5 mL加入4.5 mL BPA培養(yǎng)基，在30℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。然后置于75℃水浴中加熱20 min，殺死非芽胞桿菌類微生物。待其冷卻后，取100 μL樣品液涂布于BP平板，30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，挑取類似Bt單菌落接種于LB平板，鏡檢觀察其菌體形態(tài)。

1.2.2蘇云金芽胞桿菌的SDS-PAGE檢測(cè) 將Bt菌株接種于GYS液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)（30℃，180 r/min）約60 h，直到菌體裂解并釋放晶體。提取芽胞晶體混合物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后脫色，用蛋白膠掃描儀掃描結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.2.3蘇云金芽胞桿菌原毒素的質(zhì)譜分析 切取SDS-PAGE膠塊上的目的蛋白條帶，對(duì)其進(jìn)行膠內(nèi)酶解，將酶解所得的肽段混合物復(fù)溶在40 μL 0.1%的甲酸溶液中，離心后取30 μL溶液到樣品瓶中，采用LTQ XL質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）進(jìn)行LC-MS/MS分析［12］。

1.2.4蘇云金芽胞桿菌的16S rRNA鑒定 提取Bt菌株基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增獲得該菌株16S rRNA的編碼序列，回收PCR產(chǎn)物后克隆pMD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5蘇云金芽胞桿菌的殺蟲基因鑒定 提取Bt菌株的基因組作為PCR模板，采用cry1類基因通用引物［13］對(duì)其進(jìn)行基因型鑒定。在此基礎(chǔ)上，用cry1Ac和cry1Ae基因的特異性引物擴(kuò)增Bt菌株中的靶標(biāo)基因，回收PCR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.6蘇云金芽胞桿菌的殺蟲毒力測(cè)定 Bt菌株培養(yǎng)60 h后，離心收集芽胞晶體混合物，生理鹽水懸浮后進(jìn)行超聲波處理，蒸餾水洗滌后對(duì)芽胞晶體混合物進(jìn)行冷凍干燥，稱重后加入無菌超純水制成適當(dāng)濃度梯度的懸浮液，再與生測(cè)飼料充分混勻添加至24孔生測(cè)板，向每孔中加入1條棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）初孵幼蟲，每個(gè)濃度重復(fù)2次。將生測(cè)板置于28℃、60%濕度的光照培養(yǎng)箱中，記錄幼蟲死亡率，并用SPSS軟件計(jì)算半致死濃度LC50。

2　結(jié)果與分析

2.1蘇云金芽胞桿菌的篩選與16S rRNA序列分析

從全國各地不同土壤類型采集118份土樣，利用溫度篩選法分離純化蘇云金芽胞桿菌，其中一株被命名為Bt 6618菌株。鏡檢觀察顯示該菌株產(chǎn)生菱形伴胞晶體（圖1）。

圖1　Bt 6618菌株的晶體形態(tài)（箭頭所示為伴胞晶體）Fig.1　The shape of parasporal crystal produced by Bacillus thuringiensis strain 6618（The parasporal crystal was indicated by arrow）

擴(kuò)增Bt 6618菌株的16S rRNA基因，克隆至pMD18-T載體后進(jìn)行測(cè)序。在NCBI上對(duì)Bt 6618菌株的16S rRNA基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果表明與其同源性最高的是蘇云金芽胞桿菌Bt407，同源性為99%，Max score值為2 782，有3個(gè)堿基存在差異。

2.2蘇云金芽胞桿菌原毒素類型鑒定及相關(guān)基因分析

提取Bt 6618菌株芽胞晶體混合物并進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，結(jié)果顯示該菌株表達(dá)產(chǎn)生一條約130 kD的蛋白主帶，對(duì)照菌株HD-1產(chǎn)生130 kD和65 kD的蛋白主帶（圖2）。

圖2　Bt6618菌株芽胞晶體混合物的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of crystal-spore mixture from Bt 6618

切取SDS-PAGE膠塊上Bt 6618菌株產(chǎn)生的130 kD蛋白條帶，蛋白經(jīng)膠內(nèi)酶解后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，利用SEQUEST搜庫軟件和芽胞桿菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的原毒素主要組分為Cry1Ac和Cry1Ae。其中鑒定到Cry1Ac原毒素有47個(gè)特異肽段，序列覆蓋率達(dá)67.66%，Cry1Ae原毒素鑒定到2個(gè)高可信的特異性肽段，序列覆蓋率為23.96%。表1列出了2D-LC-MS/MS技術(shù)鑒定的Bt 6618菌株的伴胞晶體原毒素及其相關(guān)信息。

表1　Bt 6618菌株伴胞晶體中原毒素組分的質(zhì)譜鑒定Tab.1　Identification of protoxins produced by Bt 6618 through mass spectrometry analysis

根據(jù)原毒素的質(zhì)譜分析結(jié)果，采用Cry1類原毒素編碼基因的通用檢測(cè)引物對(duì)Bt 6618菌株進(jìn)行基因檢測(cè)。用cry1-Un1（d）/cry1-Un1（r）通用引物分析發(fā)現(xiàn)，Bt 6618菌株的確含有預(yù)期的cry1類基因。采用特異引物擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，該菌株所含的cry1Ac基因序列與已經(jīng)公布的cry1Ac1序列一致，而其cry1Ae基因與目前公布的cry1Ae基因序列不同，為新型cry1Ae基因。

2.3Bt 6618菌株的殺蟲毒力測(cè)定

提取Bt 6618菌株的芽胞晶體混合物并進(jìn)行冷凍干燥，分析其對(duì)棉鈴蟲初孵幼蟲的毒力。72 h統(tǒng)計(jì)致死率后計(jì)算LC50值為5.50 μg/mL，95%置信區(qū)間為3.83-5.97 μg/mL。這表明Bt 6618菌株對(duì)棉鈴蟲初孵幼蟲具有良好的殺蟲效果，目前該菌株已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏（保藏編號(hào): CCTCC NO:M2014451）。

3　討論

蘇云金芽胞桿菌在土壤中分布非常廣泛，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，來自土壤的Bt菌株占到總數(shù)的70.4%。而Bt的分布也受到多方面因素的制約，例如氣候、植被、土壤腐殖質(zhì)含量、土壤類型、pH值等理化特性等，這些都會(huì)顯著影響B(tài)t在土壤中的分布數(shù)量。本研究從全國不同地區(qū)采集了118份土樣分離蘇云金芽胞桿菌，獲得了多株Bt菌株，說明利用溫度篩選法從土壤中篩選Bt菌株具有較好的出菌率。

在篩選獲得的Bt菌株中，Bt 6618菌株產(chǎn)生非常典型的菱形伴胞晶體，其大小比其它菌株的晶體要大，且殺蟲毒力相對(duì)較高。Bt 6618菌株能同時(shí)表達(dá)Cry1Ac和Cry1Ae原毒素，目前所報(bào)道的來自Bt菌株的cry1Ae基因只有一個(gè)，而其它類型的cry基因則有很多種，例如cry1Ac基因目前已經(jīng)有38個(gè)亞類。在后續(xù)研究中，我們將對(duì)Bt 6618菌株中的cry1Ae基因進(jìn)行異源表達(dá)和功能分析，這將為構(gòu)建殺蟲工程菌及培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物提供高毒力的候選基因。

［1］ JARA S，MADUELL P，ORDUZ S.Diversity of Bacillus thuringiensis strains in the maize and bean phylloplane and their respective soils in Colombia［J］.J Appl Microbiol，2006，101（1）:117-124.

［2］ALVAREZ A，VIRLA E G，PERA L M，et al.Characterization of native Bacillus thuringiensis strains and selection of an isolate active against Spodoptera frugiperda and Peridroma saucia［J］.Biotechnol Lett，2009，31（12）:1899-1903.

［3］李建洪，萬秋英，王沫，等.韓國土壤中蘇云金芽孢桿菌菌株的分離和鑒定［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26（4）: 293-295. LI Jianhong，WAN Qiuying，WANG Mo，et al.Isolation and identification of Bacillus thuringensis from soil of Korea［J］. Journal of Hunan Agricultural University，2000，26（4）: 293-295.

［4］楊自文，吳宏文，王開梅，等.從土壤中高效分離蘇云金桿菌的方法［J］.中國生物防治，2000，16（l）:26-30. YANG Ziwen，WU Hongwen，WANG Kaimei，et al.Method for highly efficient isolation of Bacillus thuringiensis from soil［J］. Chinese Journal of Biological Control，2000，16（l）:26-30.

［5］何獻(xiàn)君，宗浩，鄭鴿，等.一株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）的分離與鑒定［J］.四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，25（3）:301-303. HE Xianjun，ZONG Hao，ZHENG Ge，et al.The isolation and characterization about Bacillus thuringiensis［J］.Journal of Sichuan Normal University（Natural Science），2002，25（3）: 301-303.

［6］SANTANA M A，MOCCIA-V C C，GILLIS A E.Bacillus thuringiensis improved isolation methodology from soil samples［J］.J Microbiol Methods，2008，75（2）:357-358.

［7］BERóN C M，CURATTI L，SALERNO G L.New strategy for identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（2）:761-765.

［8］ BEN-DOV E，MANASHEROB R，ZARITSKY A，et al.PCR analysis of cry7 genes in Bacillus thuringiensis by the five conserved blocks of toxins［J］.Curr Microbiol，2001，42（2）:96-99.

［9］MASSON L，ERLANDSON M，PUZSTAI-CAREY M，et al.A holistic approach for determining the entomopathogenic potential of Bacillus thuringiensis strains［J］.Appl Environ Microbiol，1998，64（12）:4782-4788.

［10］ BEARD C E，RANASINGHE C，AKHURST R J.Screening for novel cry genes by hybridization［J］.Lett Appl Microbiol，2001，33（3）:241-245.

［11］SCHNEPF E，CRICKMORE N，VAN RIE J，et al.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62（3）:775-806.

［12］SUN Y，ZHAO Q，XIA L，et al.Identification and characterization of three previously undescribed crystal proteins from Bacillus thuringiensis subsp.jegathesan［J］.Appl Environ Microbiol，2013，79（11）:3364-3370.

［13］SUN Y，F(xiàn)U Z，DING X，et al.Evaluating the insecticidal genes and their expressed products in Bacillus thuringiensis strains by combining PCR with mass spectrometry［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（21）:6811-6813.

Isolation and Characterization of an Insecticidal Bacillus thuringiensis Strain 6618

ZHANG Chen，HUANG Fei，LU Xiuqing，XIE Junyan，DING Xuezhi，XIA Liqiu，SUN Yunjun*
（College of Life Science，Hunan Normal University，Changsha 410081，Hunan，China）

118 soil samples were collected from different parts of our country and a new Bacillus thuringiensis strain 6618 was isolated by temperature screening method.This strain could produce typical bipyramidal crystal under microscope observation.PCR analysis showed that it contained cry1-type gene.SDS-PAGE analysis indicated that this strain expressed a major protein band about 130 kD，which was verified by mass spectrometry analysis to be the products of Cry1Ae and Cry1Ac protoxins.Sequence analysis showed that the cry1Ac gene in this strain was identical to the published cry1Ac1 gene，while the cry1Ae gene was found to be different from the known gene.The crystal-spore mixture of the strain 6618 exhibited high toxicity towards the larvae of Helicoverpa armigera.The isolated Bacillus thuringiensis strain 6618 with high toxicity will not only enrich the reserve of Bacillus thuringiensis strains of our country，but also provide resource for the development of new efficient biological pesticide.

Bacillus thuringiensis；strain screening；cry gene；mass spectrometry；insecticidal activity

Q939.1

A

1007-7146（2015）04-0373-04

2015-04-28；

2015-08-10

湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目（14K058）；湖南師范大學(xué)青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（ET13105）

張晨（1988-），女，湖南岳陽人，碩士研究生，主要從事殺蟲微生物的應(yīng)用研究。（手機(jī)）15116309018；（電子郵箱）596377120@qq.com

孫運(yùn)軍（1975-），男，漢族，湖南常德人，湖南師范大學(xué)副教授，博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。（電話）0731-88872905；（電子郵箱）sunyj@hunnu.edu.cn