?；切苋パ跄懰崧?lián)合柳氮磺胺吡啶對小鼠結(jié)腸炎模型的藥效作用及機制

賈立偉，李 欣，朱文婭，孫 濤,第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)院，北京 00048；海軍總醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 00048

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)作為炎癥性腸病的一種，表現(xiàn)出許多免疫學(xué)疾病特征，與細(xì)胞和體液免疫均有關(guān)聯(lián)[1]。主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便，有進展為結(jié)腸癌的風(fēng)險。一些并發(fā)癥如中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔等嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前臨床上常用的藥物為氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及單克隆抗體。然而這些藥物不良反應(yīng)多，使臨床應(yīng)用受到限制，如5-氨基水楊酸雖然耐受效果較好，但有肌肉抽筋、腹部絞痛、發(fā)熱、皮疹、腎損傷等不良反應(yīng)。國外文獻報道?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)、熊去氧膽酸在腸道有抗炎作用，減少小腸炎性滲透和氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)，緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[2-3]，但對此尚有爭議[4]。本研究旨在觀察TUDCA聯(lián)合SASP對小鼠實驗性結(jié)腸炎的干預(yù)效果，并探討其可能的作用機制。

材科和方法

1 主要試劑和藥品 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)(分子量為36 000 ~ 50 000，粉劑，100 g/瓶)購于美國MP公司；?；切苋パ跄懰帷⒘前愤拎べ徲诤＼娍傖t(yī)院；鄰聯(lián)甲苯胺購于上海萬疆生物技術(shù)有限公司；小鼠抗體及試劑盒均購于北京博鰲森生物技術(shù)有限公司。

2 實驗動物 健康雄性8 ~ 9周齡Balb/c小鼠50只，清潔級，體質(zhì)量(21.7±2) g，購自海軍總醫(yī)院實驗動物中心。室溫條件下常規(guī)飼養(yǎng)。

3 動物分組與處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，50只雄性Balb/c小鼠隨機分為5組，每組10只。分別為正常組、模型組、TUDCA組、SASP組、聯(lián)合組。正常組自由飲用蒸餾水，余4組小鼠自由飲用5%DSS溶液，7 d建立實驗性結(jié)腸炎模型[5]。造模前1 d，正常組、模型組給予0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液，SASP組、TUDCA組分別給予TUDCA(100 mg/kg)、SASP(500 mg/kg)，聯(lián)合組給予TUDCA(100 mg/kg)+ SASP(500 mg/kg)，藥物溶于0.9%氯化鈉注射液中，配成0.2 ml溶液，通過小鼠灌胃針灌胃方式注入藥物，1次/d。

4 觀察指標(biāo) 1)小鼠的一般情況：按照Murano等[6]標(biāo)準(zhǔn)，進行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)積分評定，每日稱量小鼠體質(zhì)量，記錄糞便性狀并行隱血試驗。2)組織學(xué)損傷評分：顯微鏡下對每個切片隨機選取10個以上高倍視野(400倍)，按照病理組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)[1]，取平均值作為組織學(xué)損傷計分。3)血清TNF-α、IL-6濃度：造模7 d后，通過眼眶后靜脈采血，3 000 r/min離心機分離血清10 min，-20℃冷藏，ELISA法檢測TNF-α、IL-6表達(dá)。4)結(jié)腸組織Hes1、ATOH1、CDX2的表達(dá)：麻醉小鼠后處死，剝離全段結(jié)腸，測量肛門距回盲部的長度，0.9%氯化鈉注射液沖洗后，取病變明顯處結(jié)腸組織40 g/L甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，HE染色。免疫組化SP法檢測小鼠結(jié)腸組織Hes1(細(xì)胞質(zhì)+細(xì)胞核)、ATOH1(細(xì)胞質(zhì)+細(xì)胞核)、CDX2(細(xì)胞核)的表達(dá)。其中以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，計算機圖像分析系統(tǒng)自動記錄陽性細(xì)胞平均光密度。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以-x±s表示，符合方差齊性的計量資料采用單因素方差分析，不符合的采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠一般情況 正常組小鼠精神狀態(tài)、飲食、活動及糞便均正常，體質(zhì)量略有增加。模型組小鼠3 d后逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、豎毛、嗜臥扎堆、黏液血便等表現(xiàn)，同時伴有不同程度的體質(zhì)量減輕。藥物組小鼠上述癥狀出現(xiàn)較晚，癥狀相對模型組較輕。

2 結(jié)腸長度的改變 與正常組相比，余4組小鼠結(jié)腸長度均縮短，各藥物組縮短程度比模型組輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；藥物組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

3 DAI計分 造模第3天，與正常組相比，模型組小鼠DAI評分顯著增高(P＜0.05)，說明造模有效。各藥物組和模型組比較，DAI積分有所下降，造模第5天開始有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)；造模第7天，TUDCA、聯(lián)合組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明TUDCA/SASP聯(lián)合用藥比單用TUDCA緩解效果更好；TUDCA、SASP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

4 組織學(xué)損傷評分 光鏡下結(jié)腸組織病理可見模型組結(jié)腸黏膜糜爛脫落，炎性細(xì)胞浸潤，腺體不完整，隱窩破壞，杯狀細(xì)胞減少或消失(圖2)。與模型組比較，藥物組黏膜損傷程度輕，炎癥細(xì)胞浸潤、糜爛潰瘍少，組織學(xué)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；TUDCA、SASP組和聯(lián)合組比較，聯(lián)合組炎癥損傷輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TUDCA、SASP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

5 血清中TNF-a、IL-6的表達(dá) 模型組小鼠血清TNF-α、IL-6高表達(dá)，各藥物組與模型組比較表達(dá)相對較低(P＜0.05)。TUDCA、SASP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

圖 1 各組小鼠DAI評分Fig. 1 Disease activity index (DAI) score of mice in fi ve groups (aP＜0.01)

6 小鼠結(jié)腸組織Hes1、Atoh1及Cdx2蛋白表達(dá)與模型組比較，正常組小鼠結(jié)腸Cdx2、Atoh1含量高(P＜0.01)，TUDCA、聯(lián)合組干預(yù)后，能增加其表達(dá)量(P＜0.01)。而Hes1在正常組表達(dá)較少， 模型組表達(dá)顯著增加，TUDCA、聯(lián)合組干預(yù)后，能抑制其表達(dá)(P＜0.01)。見表2。

表1 各組小鼠結(jié)腸長度、組織學(xué)損傷評分及血清TNF-α、IL-6表達(dá)Tab. 1 Colonic length, histological injury score and the expression of serum TNF - α, IL-6 of mice in fi ve groups(-x±s)

表2 各組小鼠結(jié)腸組織Hes1、Atoh1及Cdx2蛋白的表達(dá)Tab.2 Expression of Hes1, Atoh1 and Cdx2 protein of colon tissue in mice in fi ve groups (-x±s)

討 論

本研究觀察了牛磺熊去氧膽酸對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎實驗?zāi)Ｐ偷母深A(yù)效果，此結(jié)腸炎模型類似于人類潰瘍性結(jié)腸炎，廣泛應(yīng)用于治療方法和潛在的抗炎藥物的評估。膽汁酸釋放入腸道后，大部分在末端回腸被重吸收，但每次腸肝循環(huán)后，約30%的膽汁酸進入大腸。進入大腸的膽汁酸由于腸道菌群的影響，物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了顯著改變，包括早期解離、脫羥基、脫磺化。炎癥性腸病存在微生態(tài)失調(diào)，而這與膽汁酸的代謝障礙密切相關(guān)，尤其是減少了次級膽汁酸的水平，而親水的次級膽汁酸具有細(xì)胞保護功能[7-9]。國內(nèi)外廣泛研究的次級膽汁酸是?；切苋パ跄懰幔谌梭w中含量甚微，長期用來治療某些類型的膽汁淤積及原發(fā)性膽汁性肝硬化。已有報道證明其有效成分具有抗炎活力[4]。TUDCA能夠阻礙炎癥刺激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，許多學(xué)者推薦其作為UC新的治療選擇。本實驗進一步證明了TUDCA能有效緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型的病變程度。造模1周后，藥物組體質(zhì)量下降、結(jié)腸長度減少、疾病活動指數(shù)評分、病理組織學(xué)評分等指標(biāo)顯著改善，其中聯(lián)合組效果最明顯，說明TUDCA聯(lián)合SASP可能具有協(xié)同效應(yīng)。

TNF-α是IBD病理進程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過表達(dá)黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子，以及啟動細(xì)胞毒性反應(yīng)、凋亡和急性期反應(yīng)等過程發(fā)揮作用[10]。TNF-α的血清水平與UC和克羅恩病(Crohn' s disease，CD)的臨床活動有關(guān)[10]。目前TNF-α是潰瘍性結(jié)腸炎一個重要的治療靶點。幾種TNF-α抗體已應(yīng)用于炎癥性腸病治療，取得了良好的效果[11-12]。IL-6改變出現(xiàn)在急性炎癥狀態(tài)，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、腎小球腎炎等。IL-6主要通過STAT3信號通路在UC的發(fā)病，及隨后的UC相關(guān)結(jié)腸癌腫瘤中發(fā)揮重要作用[13]。本研究通過DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，小鼠血清TNF-α及IL-6水平顯著提高，TUDCA能降低血清TNF-α、IL-6水平。這些結(jié)果表明，TUDCA可能通過抑制炎性因子TNF-α、IL-6減輕結(jié)腸炎病變程度，與國外報道同類藥物的效果相似[14-15]。

Cdx2是一種調(diào)節(jié)上皮功能相關(guān)基因的重要核轉(zhuǎn)錄因子，并控制腸道上皮細(xì)胞的分化和增殖。近期一項研究表明，Cdx2在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)減少，Cdx2的抑制導(dǎo)致了潰瘍性結(jié)腸炎中杯狀細(xì)胞的消耗[12]，結(jié)果在活動性UC中，黏蛋白合成障礙，黏液層變薄或消失。Notch分子信號通路在細(xì)胞的分化中起到了重要的作用，Notch信號的激活導(dǎo)致其重要下游基因Hes1上調(diào)以及Atoh1(一種與Notch信號通路相關(guān)因子)下調(diào)，繼而抑制干細(xì)胞分化為杯狀細(xì)胞[16]。Atoh1是腸道特異基因Muc2的重要的轉(zhuǎn)錄激活因子。Tamagawa等[17]報道膽汁酸可以抑制Hes1，并上調(diào)Atoh1增加Cdx2表達(dá)，從而導(dǎo)致食管鱗狀上皮向柱狀上皮的轉(zhuǎn)化。本研究顯示，實驗性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織Hes1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組，Atoh1、Cdx2蛋白的表達(dá)下降。TUDCA能夠減少Hes1蛋白表達(dá)水平，增加Atoh1、Cdx2蛋白表達(dá)量，進一步說明了膽汁酸、Notch信號通路、Cdx2之間的關(guān)系。SASP是經(jīng)典的氨基水楊酸制劑，可抑制過氧化物酶活性，減少TNF-α刺激產(chǎn)生的IL-l、IL-8等細(xì)胞因子的釋放與分泌[18]。本研究也證實了SASP能降低小鼠結(jié)腸炎血清炎性因子的表達(dá)?？傊?，在小鼠實驗性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中，激活了Notch信號通路，抑制了黏蛋白的合成。TUDCA能有效緩解結(jié)腸炎癥狀，改善腸道組織病理。與SASP可能存在協(xié)同作用，聯(lián)合用藥可能優(yōu)于單獨用藥。

綜上所述，?；切苋パ跄懰崧?lián)合柳氮磺胺吡啶可通過不同機制緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。牛磺熊去氧膽酸作用機制可能是通過調(diào)節(jié)炎癥因子、抑制Notch信號傳導(dǎo)通路及增加Cdx2蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到對小鼠實驗性結(jié)腸炎的緩解作用。

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