野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡及caspase-8表達的影響

張穎，李俊玫，秦博文，葛志華△

野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡及caspase-8表達的影響

張穎1，李俊玫2，秦博文3，葛志華2△

目的探討野黃芩苷誘導(dǎo)人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的可能機制。方法將體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113細胞分成對照組和不同濃度野黃芩苷組（濃度分別為80、120、160 mg/L），每組設(shè)3個復(fù)孔。采用Tunel檢測細胞凋亡情況；采用免疫細胞化學(xué)法和Western blot法檢測caspase-8蛋白表達情況。結(jié)果 （1）80、120、160 mg/L野黃芩苷組Tca8113細胞凋亡率高于對照組［（17.63±0.25）%、（36.23±0.36）%、（51.84±0.58）%vs（4.45± 0.27）%，P＜0.05］。（2）與對照組相比，80、120、160 mg/L野黃芩苷組caspase-8蛋白的表達增加（0.283±0.040 vs 0.474±0.031、0.592±0.077、0.781±0.020，P＜0.05）。結(jié)論野黃芩苷能明顯誘導(dǎo)舌鱗癌細胞Tca8113的凋亡，可能與上調(diào)caspase-8蛋白表達有關(guān)。

舌腫瘤；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8；野黃芩苷；Tca8113細胞

舌癌是常見的口腔頜面部惡性腫瘤，多數(shù)為鱗癌，一般生長較快，浸潤性較強，惡性程度較高，易發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。目前舌癌的治療是以手術(shù)治療為主的綜合治療［1］。但術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高，5年生存率約為53%［2］。因此，尋求有效且不良反應(yīng)小的藥物來防治舌癌，對于改善患者生活質(zhì)量和提高生存率具有積極的意義。野黃芩苷是一種黃酮類化合物，是黃芩莖葉、半枝蓮中總黃酮的主要活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抑制變態(tài)反應(yīng)等多方面的藥理作用［3］。本研究采用野黃芩苷作用于體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113細胞，觀察Tca8113細胞的凋亡情況及caspase-8蛋白表達的改變，探討其對Tca8113細胞凋亡的影響及可能機制，為野黃芩苷抗癌作用的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器人舌鱗癌Tca8113細胞株（南京凱基生物科技有限公司），中藥野黃芩苷（中國生物藥品檢定所），1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，天津血液學(xué)研究所），YT-CJ-1N型潔凈工作臺（北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，日本），CO2孵箱（SANYO，日本），caspase-8一抗（美國SantaCruz公司），caspase-8二抗、3%H2O2（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），Tunel試劑盒（南京凱基生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊公司），蛋白裂解液（北京普利萊公司），辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2實驗分組實驗分為對照組和不同濃度野黃芩苷組。對照組用10%胎牛血清（FBS）的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)舌鱗癌Tca8113細胞；野黃芩苷組用10%FBS的1640培養(yǎng)液配制野黃芩苷終濃度分別為 80、120、160 mg/L處理舌鱗癌Tca8113細胞。

1.3人舌鱗癌Tca8113細胞的培養(yǎng)人舌鱗癌Tca8113細胞為單層貼壁生長。培養(yǎng)液為RPMI1640培養(yǎng)基，內(nèi)含10% FBS、青霉素和鏈霉素各100 mg/L。將Tca8113細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，根據(jù)生長情況1～2 d換液1次。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4Tunel技術(shù)檢測細胞凋亡情況

1.4.1細胞爬片、固定將濃度為1×108/L的Tca8113細胞懸液，滴加到載玻片上。每張載玻片上滴加約0.2 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。3～4 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度野黃芩苷（80、120、160 mg/L）的RPMI-1640培養(yǎng)。48 h后將載玻片先后浸入固定液中固定和封閉液中封閉。期間用PBS洗3遍，然后浸入通透液中。

1.4.2標記和顯色反應(yīng)PBS洗3遍。每個樣本滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液反應(yīng)60 min。PBS洗3遍，滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液反應(yīng)30 min，PBS洗3遍，滴加50～100 μL DAB工作液顯色10 min。PBS洗3遍，然后光學(xué)顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.4.3結(jié)果判定陽性細胞核呈棕黃色即為凋亡細胞，非凋亡細胞核呈藍色。每張切片在顯微鏡400倍下隨機讀取100個細胞，根據(jù)凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞計數(shù)×100%計算細胞凋亡率，取其均值。

1.5免疫細胞化學(xué)檢測caspase-8的表達將濃度為1×108/ L的Tca8113細胞，在每張載玻片上滴加0.2 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 h棄去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度野黃芩苷（80、120、160 mg/L）的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，并以RPMI-1640完全培養(yǎng)液作對照，48 h后甲醇固定10 min，晾干。切片經(jīng)PBS漂洗3遍。3%H2O2，處理 20 min。PBS漂洗后，滴加10%小牛血清封閉30 min。caspase-8一抗（1∶50），4℃過夜。caspase-8二抗，30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，拍照記錄結(jié)果。陽性細胞胞漿染色黃色或棕黃色。顯微鏡下取5個典型高倍視野（×200倍）?！溃宏栃约毎?～25%；+：陽性細胞26%～50%；++：陽性細胞51%～75%；+++：陽性細胞76%～100%。

1.6Western-blot檢測caspase-8的表達分別消化收集不同濃度野黃芩苷的細胞，用細胞裂解液在冰浴中裂解提取蛋白，用BCA方法測定蛋白含量，采用相同蛋白量上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，加入一抗（1∶1 000），ECL檢測試劑盒顯影和定影。用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件對各蛋白條帶和β-actin條帶進行分析，各條帶的灰度值代表其蛋白的表達量，用β-actin條帶灰度值進行校正，得出各條帶的相對灰度值。重復(fù)3次實驗取其平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，等級資料采用秩和檢驗，并用Nemenyi法進行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1野黃芩苷對Tca8113細胞凋亡的影響檢測結(jié)果對照組和野黃芩苷 80、120、160 mg/L組Tca8113細胞凋亡率分別為（4.45±0.27）%、（17.63± 0.25）%、（36.23±0.36）%、（51.84±0.58）%，凋亡率依次增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=8 628.948，P＜0.01）。對照組陽性細胞較少，野黃芩苷組隨著藥物濃度的增高，陽性細胞逐漸增多，見圖1。

Fig.1　The apoptotic expressions induced by different concentrations of scutellarin in Tca8113 cells（Tunel，×400）圖1　不同濃度野黃芩苷組Tca8113細胞凋亡表達（Tunel，×400）

2.2caspase-8表達 （1）免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示：對照組細胞caspase-8表達很弱，野黃芩苷組隨著藥物濃度的增高，caspase-8表達逐漸增強，見圖2。120 mg/L與160 mg/L組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。（2）Western-Blot檢測顯示：對照組caspase-8蛋白的表達最弱，野黃芩苷組隨著藥物濃度增高，caspase-8蛋白的表達依次遞增，見圖3。對照組及野黃芩苷各濃度組caspase-8蛋白表達量分別為0.283±0.040、0.474±0.031、0.592±0.077、0.781± 0.020，隨野黃芩苷濃度增加，各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=58.927，P＜0.01）。

Fig.2　The caspase-8 expressions induced by different concentrations of scutellarin in Tca8113 cells（DAB×200）圖2　野黃芩苷不同濃度組Tca8113細胞caspase-8的表達（DAB染色×200）

Tab.1　The expressions of caspase-8 protein in four groups of cells表1　caspase-8蛋白在各組細胞中的表達

Fig.3　Effects of scutellarin on the expression of caspase-8 in Tca8113 cells圖3　野黃芩苷不同濃度作用后Tca8113細胞caspase-8蛋白表達

3　討論

3.1caspase-8在腫瘤細胞凋亡中的作用目前認為腫瘤是細胞的凋亡被抑制而增殖趨勢加強，使生長的動態(tài)平衡遭受破壞所致。細胞凋亡受阻或減少在腫瘤的形成中起著重要作用。因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡已成為尋找有效抗癌藥物的新靶點。細胞凋亡率也成為抗腫瘤療效評價的一項新指標。促凋亡蛋白酶（caspase）是一類半胱氨酸蛋白酶。caspase能夠滅活凋亡抑制物，水解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成凋亡小體以及水解凋亡相關(guān)活性蛋白。caspase蛋白酶家族是導(dǎo)致細胞凋亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者［4］。caspase-8 是caspase家族中最重要的起始因子，它幾乎能激活所有的caspase，也是啟動死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑的關(guān)鍵因子。當Fas被FasL激活后，通過胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD（fas—associated death domain）募集并激活前體caspase-8?；罨腸aspase-8可以引起caspase的級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞凋亡。這是細胞凋亡的主要途徑之一。活化的caspase-8還能通過裂解Bid誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素C啟動線粒體/細胞色素C通路，有效放大了凋亡信號。研究表明caspase-8在宮頸癌［5］、胃腺癌［6］、乳腺癌［7］、肺癌［8］等多種腫瘤中低表達。以上研究說明，caspase-8低表達導(dǎo)致腫瘤細胞對凋亡刺激敏感性降低，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

3.2野黃芩苷對舌癌細胞凋亡及caspase-8表達的影響近年來，隨著中藥藥理學(xué)、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)等多學(xué)科研究方法和技術(shù)手段的提高，已發(fā)現(xiàn)很多中藥活性成分有抗腫瘤作用，如姜黃素［9］、白花丹素［10］可以影響舌癌細胞的增殖和凋亡。野黃芩苷是從黃芩莖葉中分離出來的黃酮類化合物，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤等藥理活性。隨著研究的逐步深入，其抗腫瘤活性日益受到重視。有研究證實半枝蓮中野黃芩苷可明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長［11］。野黃芩苷可以通過提高人舌鱗癌細胞Fas蛋白表達抑制細胞增殖而達到抗腫瘤作用［12］。

本實驗以不同濃度的野黃芩苷作用于舌鱗癌細胞Tca8113，Tunel結(jié)果顯示：隨著野黃芩苷濃度的增加，舌鱗癌Tca8113細胞的凋亡率逐漸增加。免疫細胞化學(xué)法和Western blot法檢測結(jié)果顯示：隨著野黃芩苷濃度增加，caspase-8表達逐漸增強。這些結(jié)果表明，野黃芩苷有誘導(dǎo)舌鱗癌細胞凋亡的作用，其機制可能是通過增加caspase-8蛋白的表達來啟動死亡受體通路和線粒體/細胞色素C通路這2條凋亡途徑，促進細胞的凋亡過程。

綜上所述，野黃芩苷可以通過上調(diào)caspase-8蛋白的表達來誘導(dǎo)舌鱗癌細胞的凋亡，且呈一定的量效關(guān)系。雖然野黃芩苷對腫瘤具有獨特作用，且來源廣泛、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，但其抗腫瘤機制較為復(fù)雜，且本身不溶于水，因此仍需要對野黃芩苷的抗腫瘤機制、不良反應(yīng)、藥代動力學(xué)、劑型等方面進行更深入的研究，使之成為具有藥理活性強、高穩(wěn)定性、給藥方便的新型抗癌藥物。

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（2014-08-29收稿2014-11-30修回）

（本文編輯李鵬）

The effects of scutellarin on apoptosis and the expression of caspase-8 in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells

ZHANG Ying1，LI Junmei2，QIN Bowen3，GE Zhihua2△
1Pathology Teaching and Research Section，Chengde Nursing Vocational College，Chengde 067000，China；2Department of Scientific Research，The Affiliated Hospital of Chengde Medical College；3Department of Scientific Research，Chengde Nursing Vocational College
△Corresponding AuthorE-mail：gzh9138@sina.com

ObjectiveTo investigate the possible mechanism of scutellarin on the apoptosis of human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells.MethodsHuman tongue squamous carcinoma Tca8113 cells were divided into control group and scutellarin groups（80，120 and 160 mg/L）.Tunel method was used to detect the apoptosis.Immunohistochemistry and Western blot assay was used to detect the caspase-8 protein expression of cells.Results（1）The apoptotic rates of Tca8113 cells were significantly high in scutellarin groups（80，120 and 160 mg/L）than those in control group［（17.63± 0.25）%，（36.23±0.36）%，（51.84±0.58）%vs（4.45±0.27）%，P＜0.05］.（2）Compared with control group，the expressions of caspase-8 protein were significantly increased in different concentrations（80，120 and 160 mg/L）of scutellarin groups（0.283± 0.040 vs 0.474±0.031，0.592±0.077，0.781±0.020，P＜0.05）.ConclusionScutellarin could obviously induce the apoptosis of human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells，which may be related to the caspase-8 protein expression.

tongue neoplasms；apoptosis；caspase-8；Scutellarin；Tca8113

R739.8

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.004

1承德護理職業(yè)學(xué)院病理教研室（郵編067000）；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研處；3承德護理職業(yè)學(xué)院科研處

張穎（1972），副教授，碩士學(xué)位，主要從事病理學(xué)方面研究

△E-mail：gzh9138@sina.com