PCSK9基因rs11206510多態(tài)性與血脂及冠心病的關(guān)系

譚艷萍，劉寅，高靜，孫根義

PCSK9基因rs11206510多態(tài)性與血脂及冠心病的關(guān)系

譚艷萍1，劉寅2△，高靜2，孫根義2

目的探討PCSK9 rs11206510基因多態(tài)性與脂代謝及發(fā)生冠心病（CHD）風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)研究。方法選擇在天津市胸科醫(yī)院住院患者778例，分為CHD組502例和對(duì)照組276例。入院后檢驗(yàn)三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白（Apo）A1、ApoB并檢測(cè)入選人群的基因型TT、TC、CC。結(jié)果CHD組TC基因型組LDL-C水平較TT基因型組高（P＜0.05）。CHD組和對(duì)照組均以TT基因型為主，2組基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。被檢總?cè)巳旱任换蝾l率分別為T(mén) 96.1% （1 495/1 556），C 3.9%（61/1 556）；基因型頻率分別為T(mén)T 92.2%（717/778），TC 7.8%（61/778）。多因素Logistic回歸分析ApoA1、HDL-C是CHD的保護(hù)因素。結(jié)論CHD組TC基因型與血清LDL-C的升高有相關(guān)性，而等位基因C與CHD的發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。

冠心?。欢鄳B(tài)現(xiàn)象，遺傳；載脂蛋白類(lèi)；脂蛋白類(lèi)；PCSK9

大量研究表明，冠心?。–HD）發(fā)病因素中血脂異常是其主要發(fā)病機(jī)制之一。目前，降低血液膽固醇濃度、降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）已成為近些年心血管保護(hù)的主要策略，但是LDL-C的有效控制使心血管疾病的患病率僅下降30%，而大部分不能得到有效的保護(hù)，這表明了心血管疾病是多因素疾病，需要尋找更為有效的預(yù)防措施［1-2］。常染色體顯性高膽固醇血癥（ADH）是家族早發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化的最主要的危險(xiǎn)因素。除了以前公認(rèn)的低密度脂蛋白受體（LDL-R）基因的突變，LDL-R的配體蛋白-載脂蛋白（Apo）B的功能缺陷，還涉及2003年發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)基因，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型（Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9）［3］。PCSK9是一種獨(dú)特的前蛋白轉(zhuǎn)化酶，其蛋白質(zhì)稱為NARC1（neural apoptosis-regulated con?vertase 1），一種新的前蛋白轉(zhuǎn)換酶，屬于枯草蛋白酶亞家族。PCSK9可介導(dǎo)LDL-R降解，升高LDL-C水平。PCSK9存在幾種常見(jiàn)的序列變異，這些變異對(duì)血漿膽固醇水平有很大影響。近年來(lái)PCSK9基礎(chǔ)與臨床研究不斷取得新的進(jìn)展，PCSK9基因多態(tài)性與臨床疾病的關(guān)系越來(lái)越受到研究人員和臨床醫(yī)生的關(guān)注。本研究旨在分析PCSK9 rs11206510位點(diǎn)多態(tài)性與血脂及冠心病的關(guān)系。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2012年1月—2014年1月在天津市胸科醫(yī)院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影（CAG）檢查確診為冠心病的患者502例作為CHD組，包括急性冠脈綜合征（ACS）404例和穩(wěn)定型心絞痛（SA）98例。抽取同期天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科部分住院患者276例，經(jīng)CAG及心臟超聲檢查排除心臟疾患并且肝腎功能正常者作為對(duì)照組。

1.2方法

1.2.1治療方法CHD組患者入院給予阿托伐他汀鈣（美國(guó)輝瑞制藥有限公司）20 mg，每晚1次口服。治療12周后，復(fù)查血脂水平，包括總膽固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、LDL-C、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）、ApoA1、ApoB等，以上均由TOSHIBA 120FR全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。觀察他汀類(lèi)藥物對(duì)攜帶 PCSK9 rs11206510基因型冠心病患者的血脂調(diào)節(jié)作用。記錄2組的性別、年齡、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、心率等一般資料，入院時(shí)的血常規(guī)，肝、腎功能等實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，心臟超聲檢查結(jié)果，CAG檢查等。

1.2.2基因型檢測(cè)方法用Triton低滲緩沖液溶血方法提取基因組DNA。采用PCR-RFLP基因分析方法檢測(cè)PCSK9基因rs11206510位點(diǎn)多態(tài)性。查詢文獻(xiàn)和人類(lèi)基因庫(kù)進(jìn)行檢索，確定目的基因擴(kuò)增引物序列，并經(jīng)Gene Runner程序檢測(cè)。PCSK9基因rs11206510位點(diǎn)上游引物5′-CCAGCA TTG CCA GCT TCT CTG TCT C-3′，下游引物5′-AGGAAG AGG AGC CAA AGA CGG CCA CCA CAG ACA GC-3′（上海生物工程有限公司合成）。擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度138 bp。PCR擴(kuò)增總體系共25 μL，包括引物1 μL，緩沖液5 μL，dNTP 0.5 μL，TaqE 0.3 μL，H2O 17.2 μL，人DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min，95℃30 s，62℃30 s，72℃60 s，循環(huán)35次，72℃7 min，4℃10 min。酶切反應(yīng)總體系共18 μL，包括緩沖液1.8 μL，Hin6 I 1 μL（Fermentas公司提供），H2O 3.2 μL，PCR產(chǎn)物12 μL。37℃恒溫水浴過(guò)夜，3.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察酶切產(chǎn)物。rs11206510多態(tài)性依據(jù)酶切位點(diǎn)是否存在判斷基因型：野生型純合子TT片段長(zhǎng)度為138 bp，突變型雜合子TC片段長(zhǎng)度為138 bp、102 bp、36 bp，突變型純合子CC片段長(zhǎng)度為102 bp和36 bp。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法根據(jù)公式計(jì)算各等位基因頻率，Hardy-Weinberg公式計(jì)算各基因型（p+q=1，2pq=雜合型基因頻率）的理論值（野生型:樣本總數(shù)×p2；雜合突變樣本總數(shù)×2pq；純合突變：樣本總數(shù)×q2），χ2檢驗(yàn)檢測(cè)Hardy-Weinberg平衡吻合度。SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間基因型與等位基因頻率比較用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用多因素Logistic回歸分析冠心病發(fā)病的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12組一般資料比較CHD組中男性比例、吸煙、飲酒史、糖尿病患者比例高于對(duì)照組，CHD組HDL-C水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；CHD組SBP、LDL-C、ApoA1、ApoB水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1　Comparison of basics between CHD group and the control group表1　CHD組和對(duì)照組一般資料比較

2.2基因型檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)野生型純合子TT（138 bp），突變型雜合子TC（138 bp、102 bp、36 bp），但未出現(xiàn)CC基因型（102 bp、36 bp），見(jiàn)圖1。

Fig.1　Genotype results圖1　基因型檢測(cè)結(jié)果

2.32組不同基因型與血脂關(guān)系的比較CHD組TG、LDL-C水平TC基因型組較TT基因型組高（P＜0.05），CHO、HDL-C、ApoA1、ApoB水平TC基因型組與TT基因型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組TT基因型組與TC基因型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2　Correlation of genotype with blood lipid in CHD and control groups表2　CHD組和對(duì)照組不同基因型與血脂的關(guān)系

2.4被檢人群基因型和等位基因頻率的分布狀況PCSK9 rs11206510基因型在CHD組和對(duì)照組均以野生型TT為主，而等位基因均以T為主。CHD組與對(duì)照組中，等位基因T頻率均高于等位基因C頻率。2組基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。被檢總?cè)巳旱任换蝾l率分別為T(mén) 96.1%（1 495/1 556），C 3.9%（61/1 556）；基因型頻率分別為 TT 92.2%（717/778），TC 7.8%（61/ 778），見(jiàn)表3。

Tab.3　Genotype frequencies and allele frequency distribution in CHD and control groups表3　2組基因型頻率及等位基因頻率分布

2.5多因素Logistic回歸分析結(jié)果選擇CHD組和對(duì)照組單因素分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，以血清HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB，性別（0=男性，1=女性），有無(wú)糖尿病史、吸煙史、飲酒史（0=無(wú)，1=有）作為協(xié)變量，有無(wú)冠心?。?=無(wú)，1=有）作為因變量，逐步引入多因素非條件Logistic回歸，結(jié)果顯示，ApoA1、HDL-C是冠心病的保護(hù)因素，見(jiàn)表4。

Tab.4　Multivariate Logistic regression analysis of the effect of CHD表4　影響CHD的多因素Logistic回歸分析

3　討論

冠心病是人類(lèi)健康的巨大威脅并且已成為中國(guó)人口死因構(gòu)成比例上升最快的疾病，多種危險(xiǎn)因素使冠脈受累程度高，且彌漫性血管病變多，致使冠心病病變更加嚴(yán)重，對(duì)患者的身體健康危害較大。既往研究證實(shí)在冠心病的發(fā)病因素中血脂代謝紊亂、高血壓、糖尿病、遺傳等起著重要作用。遺傳因素中，許多研究已經(jīng)證實(shí)PCSK9基因rs11206510位點(diǎn)多態(tài)性是增加冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素［4-6］。GWAS研究確定PCSK9常見(jiàn)等位基因的單核苷酸1p32號(hào)染色體上的rs11206510多態(tài)性與LDL-C水平密切相關(guān)，可使LDL-C水平升高［6］。LDL-C水平的升高是冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，因此 PCSK9基因rs11206510多態(tài)性帶有某等位基因的人群，冠心病的發(fā)病會(huì)增加。

目前關(guān)于PCSK9基因rs11206510多態(tài)性在中國(guó)人群中報(bào)道不多。Xu等［7］的研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人群等位基因C與LDL-C水平升高有關(guān)，而全基因組研究發(fā)現(xiàn)大部分是T與LDL-C水平升高有關(guān)。Guella等［8］研究發(fā)現(xiàn)等位基因C在意大利人口中與低濃度的LDL-C水平有關(guān)，而Teslovich等［9］發(fā)現(xiàn)T 與LDL-C水平升高有關(guān)。本研究表明CHD組TC基因型血清LDL-C水平比TT基因型顯著增高，而對(duì)照組LDL-C水平TT基因型較TC基因型高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究未見(jiàn)CC基因型出現(xiàn)，可能與樣本數(shù)量不夠大及存在地區(qū)、人群差異有關(guān)。關(guān)于等位基因頻率分布，Zhang等［10］的研究發(fā)現(xiàn)PC?SK9基因rs11206510等位基因C頻率是6.5%，等位基因T頻率是93.2%，Xu等［7］研究發(fā)現(xiàn)等位基因C頻率在白種人是19%，而在本研究中等位基因C頻率是3.9%，明顯低于其他研究，存在較大的地區(qū)差異、人群種族差異。GWAS研究發(fā)現(xiàn)rs11206510與冠心病的發(fā)生有關(guān)。Zhang等［10］的薈萃分析發(fā)現(xiàn)rs11206510與歐洲人群冠心病的發(fā)生有關(guān)，但在亞洲人群中卻未發(fā)現(xiàn)。Teslovich等［9］發(fā)現(xiàn)等位基因T與冠心病的發(fā)生有關(guān)，Xu等［7］的研究發(fā)現(xiàn)等位基因T在中國(guó)漢族人群中與早發(fā)冠心病有關(guān)。而在本研究中被檢人群基因型及等位基因CHD組和對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此 PCSK9基因rs11206510位點(diǎn)等位基因C可能不是中國(guó)天津地區(qū)冠心病發(fā)病的易感基因。

本研究單個(gè)指標(biāo)男性、吸煙、飲酒、糖尿病、LDL-C、HDL-C、ApoA1等CHD組和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單個(gè)指標(biāo)進(jìn)行冠心病影響因素的多因素Logistic回歸分析顯示，HDL-C、ApoA1是冠心病發(fā)病的保護(hù)因素。ApoA1是高密度脂蛋白中的主要蛋白，是細(xì)胞膜上的HDL-C受體結(jié)合的載體，同時(shí)具有維護(hù)HDL-C結(jié)構(gòu)的作用。HDL-C是逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)源性膽固醇酯，在降低血液中膽固醇酯、抗炎、抗氧化方面具有重要作用。因此認(rèn)為提高HDL-C可有效地改善血脂，降低冠心病的發(fā)病率［11］。

綜上所述，關(guān)于PCSK9基因rs11206510位點(diǎn)的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，對(duì)其更加深入的研究有助于研究者進(jìn)一步理解動(dòng)脈粥樣硬化的病理病程和發(fā)展新的藥物。

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（2014-07-03收稿2014-09-22修回）

（本文編輯魏杰）

Relationship between PCSK9 gene polymorphorism rs11206510 with blood lipid level and coronary heart disease

TAN Yanping1，LIU Yin2△，GAO Jing2，SUN Genyi2
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital
△Corresponding AuthorE-mail：liuyin2088@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between PCSK9 gene polymorphism with lipid metabolism and CHD risk among population within Tianjin，China.MethodsPatients from Tianjin Chest Hospital were selected（n=778）and divided into coronary heart disease（CHD）group（n=502）and control group（n=276）.Immediately after admission，tri?glyceride（TG），high density lipoprotein（HDL-C），low density lipoprotein（LDL-C），apolipoprotein A（ApoA1）and apolipo?protein B（ApoB）were tested and genotype TT，TC and CC were determined.ResultsIn CHD group，LDL-C level is higher in TC genotype individuals than that in TT genotype individuals with statistical significance（P＜0.05）.CHD group and the control group were dominated by TT genotype with no statistical difference between their allele frequency distribution nor genotype frequency distribution（P＞0.05）.The total population allele frequencies were T 96.1%（1 495/1 556），C 3.9%（61/ 1 556）；genotype frequencies were TT 92.2%（717/778），TC 7.8%（61/778）.Multivariate Logistic regression analysis revealed that ApoA1 and HDL-C were inversely associated with coronary heart disease，therefore are protective factors for coronary heart disease.ConclusionThe study found that TC genotype is correlated with serum LDL-C increase in group CHD，and the incidence of allele C showed no obvious connection with CHD.

coronary disease；polymorphism，genetic；apolipoproteins；lipoproteins；PCSK9

R541.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.017

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科

譚艷萍（1990），女，碩士在讀，主要從事心血管內(nèi)科研究

△E-mail：liuyin2088@163.com