MACC1及c-Met在前列腺癌組織中的表達(dá)

何彬，吳長利，胡海龍，王暉△

MACC1及c-Met在前列腺癌組織中的表達(dá)

何彬1，吳長利1，胡海龍2，王暉1△

目的探討結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）及肝細(xì)胞生長因子受體（c-Met）在前列腺癌中的表達(dá)及其與前列腺癌發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法采用枸椽酸-微波-SP免疫組織化學(xué)染色法檢測67例前列腺癌組織及30例前列腺增生（BPH）組織中MACC1和c-Met的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理因素進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果MACC1 及c-Met表達(dá)水平在前列腺癌組織中不同Gleason分級、病理分級、前列腺特異性抗原（PSA）水平及根治術(shù)后是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），而不同年齡，是否吸煙的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且Ⅲ期和Ⅳ期前列腺癌中MACCl的高表達(dá)率明顯高于BPH（P＜0.05），c-Met蛋白高表達(dá)率僅在Ⅳ期前列腺癌高于BPH （P＜0.05）。前列腺癌中MACC1與c-Met的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存曲線表明前列腺癌組織中MACC1及c-Met高表達(dá)較低表達(dá)無骨轉(zhuǎn)移生存時(shí)間短且生存率低。結(jié)論MACC1和c-Met的異常高表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)展及浸潤密切相關(guān)，且預(yù)示骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，可能成為多種惡性腫瘤判斷預(yù)后、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。

原癌基因蛋白質(zhì)c-Met；前列腺腫瘤；免疫組織化學(xué)；結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1

前列腺癌是世界范圍導(dǎo)致男性腫瘤相關(guān)死亡的第六大疾病，在美國居第一位［1］。在我國的發(fā)病率逐年上升，成為老年人群的常見?。?］。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子 1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）是2009年Stein等［3］在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種因子，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖等機(jī)制中與肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/肝細(xì)胞生長因子受體（c-Met）信號系統(tǒng)密切相關(guān)。但有關(guān)MACC1在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)觀察MACC1及c-Met在前列腺癌和前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）組織中的表達(dá)及與臨床病理特征和隨訪中骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)系，為判斷預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源選取天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2006年1月—2009年6月前列腺癌標(biāo)本67例，BPH組織標(biāo)本30例。Gleason分級：4～6分13例，7分17例，8～10分37例。TNM分期：Ⅰ期1例、Ⅱ期32例、Ⅲ期22例、Ⅳ期12例。Ⅰ期、Ⅱ期和部分Ⅲ期標(biāo)本（9/22）來自前列腺根治性手術(shù)切除標(biāo)本，其余Ⅲ期和Ⅳ期患者均來自前列腺癌穿刺或經(jīng)尿道電切。所有患者均在術(shù)前行MRI或PET-CT提示分期，且術(shù)前均未行放療和內(nèi)分泌治療。

1.2免疫組化方法將組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，切片脫蠟至水，在3%過氧化氫-微波-甲醇中浸泡10 min以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，采用枸椽酸-微波-SP法在10 mmol/L枸櫞酸（pH 6.0）中煮沸5 min，保溫10 min，10%羊血清封閉。即用型PV900試劑盒及DAB顯色劑（購自北京中杉生物技術(shù)公司）和兔抗人MACC1多克隆抗體（購自Abcam）。兔抗人c-Met多克隆抗體（購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），PBS代替一抗作陰性對照，MACC1陽性表達(dá)的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移切片作陽性對照；c-Met陽性表達(dá)的乳腺癌組織切片做陽性對照。

1.3結(jié)果判定隨機(jī)讀取有代表性的10個高倍鏡視野觀察陽性細(xì)胞。每個視野計(jì)數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，采用雙評分半定量法進(jìn)行評分。（1）根據(jù)染色程度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。（2）按陽性細(xì)胞百分比評分：不著色為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50% 為3分。以兩者積分相加為該片得分：0～2分為低表達(dá)狀態(tài)，3～6分為高表達(dá)狀態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化結(jié)果中表達(dá)強(qiáng)度的比較采用χ2檢驗(yàn)。表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MACC1及c-Met免疫組化結(jié)果結(jié)果顯示，MACC1在前列腺癌中主要定位于胞漿，少數(shù)伴有胞核著色，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒狀。c-Met在前列腺癌中主要定位于胞膜，部分有胞漿著色，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒狀；MACC1和c-Met在良性增生組織可存在表達(dá)，見圖1。

2.2BPH和前列腺癌中MACC1和c-Met表達(dá)情況

2.2.1MACC1在不同組織及臨床分期表達(dá)情況BPH與前列腺癌組織中MACCl的高表達(dá)率分別為40%（12/30）和71.6%（48/67），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.793，P=0.003）；其中前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期的MACCl蛋白的表達(dá)水平與BPH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ、Ⅳ期均高于BPH，且Ⅳ期高于Ⅲ期，見表1。前列腺癌組織中不同Gleason分級、病理分級、前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平及根治術(shù)后是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移MACC1的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同年齡、是否吸煙的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.1　Comparison of MACC1 and c-Met expressions in benign prostatic hyperplasia tissues and prostate cancer tissues表　1BPH與前列腺癌組織中MACC1和c-Met的表達(dá)情況比較　例（%）

2.2.2c-Met在不同組織及臨床分期表達(dá)情況BPH與前列腺癌組織中c-Met的高表達(dá)率分別為50.0%（15/30）、59.7%（40/67），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.794，P=0.373）；其中前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期c-Met蛋白表達(dá)水平與BPH相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Ⅳ期c-Met表達(dá)水平高于BPH和Ⅰ～Ⅱ期，見表1。前列腺癌組織中不同Gleason分級、病理分級、PSA水平及根治術(shù)后是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移c-Met的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同年齡、是否吸煙的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.2.3前列腺癌組織中MACC1和c-Met表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MACC1和c-Met在前列腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，見表3。

2.2.4隨訪情況67例前列腺癌中有42例行前列腺癌根治術(shù)，術(shù)后隨訪12～60個月，其中發(fā)生骨轉(zhuǎn)移16例，骨轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間為6～40個月，中位發(fā)生時(shí)間為17個月，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期前列腺癌組織中骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為30.3%（10/33）和66.7%（6/9）。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明前列腺癌組織中MACC1及c-Met的高表達(dá)組較低表達(dá)組無骨轉(zhuǎn)移生存時(shí)間短且生存率低，見圖2、3。

Tab.2　Expression of MACC1 and c-Metin in prostate cancer tissues表2　MACC1和c-Met蛋白在前列腺癌中的表達(dá)情況

Tab.3　Correlation between MACC1 and c-Met expression in prostate cancer tissues表3　MACC1和c-Met在前列腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

3　討論

3.1MACC1蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能MACC1蛋白含有852個氨基酸，其中包括ZU5結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸模體、DD1區(qū)和DD2區(qū)結(jié)構(gòu)片段［3］。Stein等［4］在SW480結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)MACC1可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖，且在異體移植的模型上，MACC1可以誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞在肺、肝臟上出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。其在除腸癌以外的許多實(shí)體腫瘤，如胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、腎癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等中均有表達(dá)，且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖等［5］。

Fig 2　The metastatic bone-free survival curves of high and low MACC1 expression groups圖2　MACC1高表達(dá)與低表達(dá)組的無骨轉(zhuǎn)移生存曲線

Fig 3　The metastatic bone-free survival curves of high and low c-Met protein expression groups圖3　c-Met高表達(dá)與低表達(dá)組的無骨轉(zhuǎn)移生存曲線

3.2HGF/c-Met信號通路及其在腫瘤組織中的異常高表達(dá)HGF/c-Met信號通路廣泛存在于各種組織中，對多種組織器官的生長發(fā)育具有重要的生理調(diào)節(jié)作用［6］。生理?xiàng)l件下，HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，c-Met存在于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，HGF與其特異性受體c-Met結(jié)合后可誘導(dǎo)c-Met蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，激活受體胞內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的蛋白酪氨酸激酶（PTK），PTK的激活可導(dǎo)致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化，再經(jīng)級聯(lián)式磷酸化反應(yīng)，將信號逐級放大，最終轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，引起一系列生物效應(yīng)［7］。近年來則發(fā)現(xiàn)在一些惡性腫瘤組織，如胃癌、直結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、甲狀腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌等中存在HGF及c-Met過度表達(dá)而且預(yù)示腫瘤預(yù)后差［8］。c-Met蛋白異常高表達(dá)在前列腺癌進(jìn)展過程中也起了重要作用，尤其是在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移及去勢抵抗性前列腺癌中異常高表達(dá)，因此在晚期或進(jìn)展期前列腺癌中應(yīng)用c-Met抑制劑將成為一種新的治療手段［9］。

3.3MACC1與HGF/c-Met信號通路的關(guān)系進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MACC1是HGF/c-Met信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［4］。Stein等［10］認(rèn)為MACC1與HGF/c-Met之間存在一個正反饋環(huán)路：HGF促進(jìn)MACC1由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，在核內(nèi)MACC1與c-Met啟動子區(qū)的Spl結(jié)合，進(jìn)而激活c-Met啟動子，上調(diào)c-Met的轉(zhuǎn)錄，從而使得更多的HGF與過度表達(dá)的c-Met結(jié)合，激活下游信號通路，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞活性增強(qiáng)及腫瘤組織大量增殖，間質(zhì)細(xì)胞中HGF也出現(xiàn)異常高表達(dá)，這又促進(jìn)MACC1不斷轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，激活HGF/ c-Met信號通路，不斷啟動細(xì)胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)通路。

3.4MACC1與c-Met表達(dá)及根治術(shù)后隨訪情況分析本文的前列腺癌組織中MACC1與c-Met的表達(dá)呈正相關(guān)，這符合了MACC1與HGF/c-Met信號通路之間存在一個正反饋環(huán)路，且MACC1恰恰是HGF/c-Met信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本文MACC1蛋白在前列腺癌組織中，Ⅲ期及Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期中的表達(dá)，即MACC1蛋白的表達(dá)在腫瘤發(fā)生周圍侵犯或轉(zhuǎn)移的情況下明顯高表達(dá)。體外研究報(bào)道，MACC1在前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中的表達(dá)明顯增高；反義干預(yù)MACC1后能明顯減弱前列腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞增殖能力［11］。本文中c-Met蛋白僅在發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ⅳ期前列腺癌組織中表達(dá)率明顯增高，且高于BPH及Ⅰ～Ⅱ期前列腺癌中的表達(dá)，但Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期的c-Met蛋白與BPH表達(dá)水平相比差異不明顯，這與Russo等［12］結(jié)果一致，Russo認(rèn)為無腫瘤人群尿中c-Met表達(dá)與每個局限性前列腺癌的亞組無明顯差異（P=0.17），而與前列腺癌出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)c-Met表達(dá)有明顯差異（P＜0.000 1）。本文考慮c-Met蛋白參與了BPH組織的增殖，可大量出現(xiàn)于增生組織中，因此，與局限性Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期前列腺癌比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但當(dāng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)c-Met才會異常高表達(dá)。而MAC?Cl蛋白的表達(dá)不僅在發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ⅳ期與BPH相比差異明顯，而且Ⅲ期與BPH相比也同樣存在差異，故本文推測在MACC1的作用機(jī)制中不僅通過c-Met的表達(dá)，還可通過其他機(jī)制實(shí)現(xiàn)。Galimi等［13］在結(jié)腸癌的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)論。本文中42例根治患者術(shù)后隨訪僅16例出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，生存曲線顯示MACC1和c-Met高表達(dá)組均較低表達(dá)組無骨轉(zhuǎn)移生存時(shí)間短及生存率低，故本文考慮前列腺癌組織中當(dāng)MACC1及c-Met高表達(dá)時(shí)根治術(shù)后易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其可能成為惡性腫瘤判斷預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述，本文認(rèn)為MACC1及c-Met的高表達(dá)與病理分期、Gleason分級、PSA數(shù)值及根治術(shù)后是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示MACC1及c-Met在前列腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用，且與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，為腫瘤的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

（圖1見插頁）

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（2014-06-24收稿2014-10-13修回）

（本文編輯李鵬）

Expressions of MACC1 and c-Met genes in prostate cancer tissues

HE Bin1，WU Changli2，HU Hailong2，WANG Hui1△
1 Department of Intestine，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin Research Institute of Urology，Tianjin 300211，China；2 Department of Urology，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin Research Institute of Urology
△Corresponding Author E-mail:doctorwh888@126.com

ObjectiveThis study is to investigate the expressions of MACC1 and c-Met genes in prostate cancer tis?sues and to explore the relationship between these gene expressions with the development，invasion and metastasis of pros?tate cancer.MethodsThe expressions of MACC1 and c-Met genes were examined in 30 cases of benign prostatic hyperpla?sia and 67 cases of prostate cancer using citron acid-microwave-SP immunohistochemical method and analysed with their clinical pathological features.ResultsExpressions of MACC1 and c-Met in prostate tissues show statistical difference ac?cording to Gleason score，PSA level，pathological stages and whether bone metastasis occurs after radical surgery（P＜0.05 or P＜0.01），but their expressions in prostate tissue show no significant difference among different sex，age and whether smoking or not.Expression of MACC1 in prostate tissue of stageⅢandⅣcancer is significantly higher than that in benign prostatic hyperplasia（BPH）tissues（P＜0.05）while the expression of c-Met only shows statistical difference in prostate tis?sue of stageⅣcancer compared with that in BPH（P＜0.05）.There is a positive correlation between the expression of MACC1 with expression of c-Met in prostate cancer tissues（P＜0.01）.Kaplan-Meier curves revealed that the survival rates was lower and survival time of bone-free metastasis were shorter in patients with high MACC1 and c-Met expressions in prostate tissue than those with low expressions of MACC1 and c-Met in prostate tissue.ConclusionExpression of MACC1 and c-Met is closely related to the development，invasion and metastasis of prostate cancer，so MACC1 and c-Met may be used as promising diagnostic and prognostic markers for prostate tumor，and as new therapeutic targets for prostate cancer.

proto-oncogene proteins c-Met；prostatic neoplasms；immunohistochemistry；metastasis-associated in co?lon cancer 1（MACC1）

R737.25

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.016

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30700834）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（12ZCDZSY16600）

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肛腸外科，天津市泌尿外科研究所（郵編300211），2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所

何彬（1980.11），女，主治醫(yī)師，碩士在讀。研究方向：泌尿外科

△E-mail:doctorwh888@126.com