間充質(zhì)干細(xì)胞移植減輕大鼠肺氣腫及氧化應(yīng)激的探討

金志賢，畢虹，周開華，杜俊毅，陳敏，王清△，潘興華

間充質(zhì)干細(xì)胞移植減輕大鼠肺氣腫及氧化應(yīng)激的探討

金志賢1，畢虹1，周開華1，杜俊毅1，陳敏1，王清1△，潘興華2△

目的研究間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植在肺氣腫大鼠氧化應(yīng)激和肺氣腫發(fā)展過程中的作用。方法26只雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組（A組，n=8），肺氣腫組（B組，n=8），肺氣腫+MSCs移植組（C組，n=10），將B與C組大鼠在香煙煙霧中暴露14周，制作肺氣腫大鼠模型，C組大鼠予MSCs移植。完成4次MSCs移植后的2、4周分別處死C組大鼠各1只，觀察MSCs在肺氣腫大鼠肺部的定植情況；MSCs移植8周后同時處死各組大鼠，觀察大鼠肺組織病理形態(tài)，并進(jìn)行定量分析；用硫代戊巴比妥法測定血清和肺組織勻漿中丙二醛（MDA）的水平，用WST-1法測定各組血清和肺組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）的水平。結(jié)果MSCs移植后2周及4周，C組大鼠肺組織內(nèi)均可見標(biāo)記過的MSCs，隨著時間的推移，肺組織內(nèi)MSCs比例逐漸減少。B組和C組大鼠的肺組織呈現(xiàn)肺氣腫樣改變，B組和C組大鼠肺組織的平均內(nèi)襯間隔（MLI）高于A組，平均肺泡數(shù)（MAN）明顯低于A組，B組大鼠肺組織的MLI高于C組，MAN低于C組（P＜0.05）。B組和C組大鼠血清及肺組織中MDA高于A組，SOD低于A組，B組血清及肺組織中MDA高于C組，SOD低于C組（P＜0.05）。結(jié)論MSCs移植可能通過降低氧化應(yīng)激水平對大鼠肺氣腫發(fā)揮治療作用。

肺氣腫；間質(zhì)干細(xì)胞；氧化性應(yīng)激；間質(zhì)干細(xì)胞移植

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是患病率及死亡率均較高的最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。COPD的病理改變包括小氣道炎癥及肺氣腫。肺氣腫是COPD非常關(guān)鍵的病理改變，以肺泡壁缺失及終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的空腔永久性擴(kuò)大為特征。肺氣腫的形成是一個不可逆的病理過程，目前尚無治愈肺氣腫的有效方法。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是未分化的細(xì)胞，可從骨髓或其他器官動員到損傷組織，分化成不同的細(xì)胞表型，以發(fā)揮修復(fù)功能，有研究表明MSCs對肺纖維化［1］、肺高壓［2］及急性肺損傷［3］有治療作用。關(guān)于MSCs治療肺氣腫的研究很少，本研究通過分析MSCs移植對大鼠肺氣腫的治療效果，從氧化應(yīng)激方面探討MSCs治療肺氣腫的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料SPF級健康雌性SD大鼠26只（昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心），動物質(zhì)量合格證號：SCXK（滇）2011-0004，鼠齡6周，體質(zhì)量（150±10）g；紅梅烤煙型香煙（紅塔煙草有限責(zé)任公司）；胎牛血清（Bi以色列）；DMEM/ F12，0.25%Trypsin-EDTA（Hyclone）；Anti-Rat CD45 FITC、an?ti-Rat/mouse CD90-FITC、Anti-Rat CD44H PE及FITC、FE同型對照（eBioscience），anti-mouse CD34 FITC（Santa Cruz）；4，6-二乙?；?2-苯基吲哚（DAPI，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；MDA試劑盒、SOD試劑盒均購自南京建成生物研究所）。

1.2實驗動物分組及動物模型的建立將大鼠隨機(jī)分為3組，對照組（A組）、肺氣腫組（B組）每組各8只，肺氣腫+ MSCs移植組（C組）10只。參照文獻(xiàn)［4］自制大鼠實驗性被動吸煙裝置，復(fù)制肺氣腫模型，方法稍有改變。將B組和C組大鼠置于自制的煙霧暴露箱中（熏煙箱體積0.6 m3，可于每側(cè)箱壁鉆5個通風(fēng)孔，每孔1 cm×1 cm，以防止CO中毒），采用紅梅烤煙型香煙（焦油量11 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣CO量：12 mg）放入箱內(nèi)自然燃燒。點燃時，每次熏煙15支，以5 支-5支-5支方式連續(xù)點燃（即5支同時點燃，至香煙燃燒完全、煙霧基本消失，再點燃下5支），共約45 min，此期間，艙內(nèi)煙霧體積百分比約為15%（V/V）［5］。取出大鼠，清洗煙霧暴露箱。4 h后重復(fù)上述煙霧暴露。每天煙霧暴露2次，每周5 d，持續(xù)14周。A組大鼠在常氧下飼養(yǎng)14周，除不予煙霧暴露外，其他飼養(yǎng)條件相同。

1.3MSCs的分離、培養(yǎng)將6周鼠齡SD大鼠脫臼處死后，無菌條件下取大鼠股骨，用咬骨鉗將股骨兩端剪去，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔獲取骨髓細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM/F12（10%FBS）重懸細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時進(jìn)行消化，以1∶2比例進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，通過多次傳代對細(xì)胞進(jìn)行純化，取第3代MSCs進(jìn)行鑒定、標(biāo)記和體內(nèi)干預(yù)實驗。

1.4MSCs的表型鑒定取第3代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、PBS洗滌l～2遍后，離心收集細(xì)胞。取1×106個細(xì)胞，加入350 μL流式細(xì)胞染色洗滌液，混勻后以50 μL/管加入7個流式管中。分別加入2 μL熒光標(biāo)記的單抗CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、CD44-PE、同型對照FITC及PE，設(shè)1管空白對照，每管加入48 μL PBS，室溫避光孵育30 min。然后每管加入400 μL 1%的多聚甲醛。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)。

1.5MSCs的標(biāo)記與肺氣腫大鼠MSCs移植于移植當(dāng)天，取第3代大鼠MSCs，加入無菌的DAPI至終濃度為50 g/L。在37℃孵育30 min，標(biāo)記完成后，0.25%胰酶-0.1%EDTA液常規(guī)消化獲得細(xì)胞懸液。離心后PBS反復(fù)洗滌以去除未結(jié)合的DAPI，離心收集細(xì)胞，稀釋至1×107/mL，放于冰浴中。1 h內(nèi)將細(xì)胞通過尾靜脈注入C組大鼠體內(nèi)，細(xì)胞數(shù)約5× 106/只，每周1次，連續(xù)4次。A組及B組注入等體積PBS。

1.6觀察MSCs在肺氣腫大鼠肺及其他組織的定植情況在完成4次MSCs移植后的2周、4周分別處死C組大鼠各1只，取新鮮組織行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察大鼠肺組織及心、肝、胰、脾、腎中DAPI標(biāo)記細(xì)胞（即MSCs）的定植、分布情況。

1.7血清和肺組織的留取MSCs移植8周后處死剩余所有大鼠。戊巴比妥鈉（5 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠。腹主動脈部穿刺抽血，以促凝采血管采血至約5～7 mL，可放血處死大鼠，將采血管在室溫下充分靜置后，3 000 r/min離心15 min，用移液管吸取上清，以2 mL EP管分裝成兩管，標(biāo)記封口后保存于-70℃冰箱備用。切斷肋骨入胸，暴露氣管、肺臟和心臟，切斷主支氣管，用彎鉗將其提起，沿背部脊柱前方分離，將心臟和肺臟一起分離下來，剪去心臟。結(jié)扎右主支氣管，右肺放-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ僖猿掷m(xù)25 cmH2O （1 cmH2O=0.098 kPa）的壓力向氣管內(nèi)注入4%多聚甲醛至左肺膨脹，左肺葉浸泡于4%多聚甲醛液中固定2 h，將左肺作常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.8大鼠肺組織病理切片形態(tài)定量分析每只大鼠各取左肺最大橫徑處肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色作常規(guī)病理學(xué)檢查。每例標(biāo)本選2張切片，按Robbesom等［6］的方法，在光學(xué)顯微鏡下（×100）觀察，每切片取5個視野（避開大血管和支氣管），在每個視野正中心劃十字交叉線，計算與交叉線相交的肺泡隔數(shù)（NS）和每個視野內(nèi)肺泡數(shù)（Na），同時測出十字線總長（L）和每個視野面積（S），按公式平均內(nèi)襯間隔（MLI）=L/NS，其數(shù)值反映肺泡平均直徑。按公式平均肺泡數(shù)（MAN）=Na/S，計算平均肺泡數(shù)，其數(shù)值反映肺泡的密度。

1.9測定肺組織勻漿與血清中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的水平制備肺組織勻漿，按照試劑盒說明書要求操作，用硫代戊巴比妥法測定血清和肺組織勻漿中MDA的水平，用WST-1法測定各組血清和肺組織勻漿中SOD的水平。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示，多組比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MSCs的鑒定第3代MSCs高表達(dá)CD44 （97.2%）、CD90（97.7%），而不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34（0.4%）及CD45（0.5%），證實本實驗培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs，見圖1。

Fig.1　Immunophenotyping of MSCs圖1　MSCs細(xì)胞表面分子標(biāo)志鑒定

2.2DAPI標(biāo)記MSCsDAPI標(biāo)記30 min后，MSCs細(xì)胞核在熒光顯微鏡下全部標(biāo)記上并顯示藍(lán)色熒光，標(biāo)記率達(dá)100%。

2.3肺及其他組織中MSCs檢測DAPI標(biāo)記后的MSCs可以看見藍(lán)色的細(xì)胞核。熒光顯微鏡下隱約可見肺泡輪廓，MSCs移植后2周、4周，肺組織內(nèi)均可見到藍(lán)色熒光表達(dá)，隨著時間的推移，肺內(nèi)陽性細(xì)胞比例逐漸減少。而心、肝、胰、脾、腎等組織均未見到藍(lán)色熒光表達(dá)，見圖2。

Fig.2　Implantations of MSCs in lungs under a fluorescence microscope（×100）圖2　熒光顯微鏡下肺組織中的MSCs（×100）

2.4肺組織病理學(xué)觀察A組大鼠肺組織肺泡大小均勻，肺泡數(shù)目較多，肺泡間隔較厚。B組和C組大鼠的肺組織呈現(xiàn)肺氣腫樣改變，肺泡大小不一，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡間隔變窄，并有不同程度的斷裂。C組肺氣腫樣改變較B組明顯減輕，見圖3。B組和C組大鼠肺組織的MLI高于A組，MAN低于A組，B組大鼠肺組織的MLI高于C組，MAN低于C組（P＜0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of MLI and MAN between three groups表1　各組大鼠平均內(nèi)襯間隔與平均肺泡數(shù)比較?。ā纒）

Tab.1　Comparison of MLI and MAN between three groups表1　各組大鼠平均內(nèi)襯間隔與平均肺泡數(shù)比較?。ā纒）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F n 80 80 80 MLI（μm）74.48±10.25 111.40±23.01a90.33±14.59ab97.13＊＊MAN（個/mm2）158.64±21.62 93.72±21.88a125.47±15.18ab214.98＊＊

2.5SOD和MDA水平的測定B組和C組大鼠血清及肺組織中MDA高于A組，SOD低于A組，B組血清及肺組織中MDA高于C組，SOD低于C組（P＜0.05），見表2。

Tab.2　The levels of MDA and SOD in serum and lungbetween three groups表2　各組血清與肺組織勻漿中MDA及SOD水平比較?。╪=8，±s）

Tab.2　The levels of MDA and SOD in serum and lungbetween three groups表2　各組血清與肺組織勻漿中MDA及SOD水平比較?。╪=8，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F血清MDA （mol/L）3.04±0.36 4.29±0.76a3.69±0.43ab10.65＊SOD （U/mL）10.47±0.87 8.72±0.83a9.58±0.74ab9.18＊肺組織MDA （mol/g）4.22±0.57 5.36±0.51a4.83±0.43ab10.06＊SOD （U/mg）84.93±12.95 56.28±13.36a70.18±11.00ab10.55＊

3　討論

吸煙是COPD發(fā)病最重要的危險因素。本研究使大鼠被動吸煙發(fā)生肺氣腫，以模擬人類COPD的發(fā)病過程。慢性炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激參與吸煙導(dǎo)致COPD的發(fā)病過程，氧化應(yīng)激在其中起樞紐作用。機(jī)體可以通過內(nèi)源性與外源性途徑產(chǎn)生氧化劑（如活性氧族），同時肺擁有廣大的細(xì)胞內(nèi)外抗氧化防御系統(tǒng)，正常情況下機(jī)體氧化劑的損害作用及抗氧化劑的保護(hù)作用處于動態(tài)平衡狀態(tài)。吸煙使氧化劑產(chǎn)生過多，使抗氧化劑產(chǎn)生不足或功能受損，從而發(fā)生氧化應(yīng)激?；钚匝踔饕艏?xì)胞膜多不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物（如MDA），與非吸煙健康者相比，COPD患者及吸煙者的痰液、肺組織及血清中MDA水平增加，且與COPD嚴(yán)重程度相關(guān)［7-8］。氧化應(yīng)激可上調(diào)氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子（如核因子-κB）及活化蛋白-1（AP-1），激活其下游信號傳導(dǎo)通路，調(diào)控多種炎癥基因表達(dá)，從而放大慢性炎癥反應(yīng)；氧化應(yīng)激可以促進(jìn)蛋白酶的產(chǎn)生、激活，導(dǎo)致蛋白酶/抗蛋白酶失衡；氧化應(yīng)激可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、激活核因子-κB及直接損傷DNA等途徑誘發(fā)肺泡細(xì)胞凋亡；從而導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)泡壞，肺泡腔擴(kuò)大，形成肺氣腫，促進(jìn)COPD的進(jìn)展。故戒煙及抗氧化應(yīng)激是預(yù)防COPD進(jìn)展最重要、最有效的方法［9］。但有研究報道，在戒煙之后，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等仍在繼續(xù)［10-11］。

MSCs移植作為一種生物治療手段，具有易分離、培養(yǎng)，可大量擴(kuò)增，具有多分化潛能及具有免疫抑制屬性等多種特性，對多種呼吸系統(tǒng)疾病，如肺氣腫、急性肺損傷及肺纖維化等具有治療作用［12］。MSCs在調(diào)節(jié)氧化還原環(huán)境中的作用是目前研究的熱點。血紅素氧化酶-1（HO-1）具有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激及細(xì)胞保護(hù)作用［13］。在脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷模型中，MSCs移植可以明顯增加肺組織HO-1的水平而降低過氧化物MDA水平［14］。另一項研究表明，在自發(fā)性腦卒中模型中，MSCs移植可以降低腦組織中氧化應(yīng)激的水平［15］。

本研究結(jié)果顯示，MSCs移植可以減輕吸煙所致的大鼠肺氣腫：肺氣腫組和肺氣腫+MSCs移植組大鼠的肺組織呈現(xiàn)肺氣腫樣改變，肺泡大小不一，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡間隔變窄，并有不同程度的斷裂。肺氣腫+MSCs移植組的肺氣腫樣改變較肺氣腫組明顯減輕，提示MSCs可以減輕吸煙所致的肺氣腫。肺氣腫+MSCs移植組與肺氣腫組比較，血清及肺組織中MDA的水平下降；而SOD的水平升高。提示MSCs可以降低肺氣腫大鼠氧化應(yīng)激水平。由于氧化應(yīng)激是肺氣腫發(fā)病過程的中心環(huán)節(jié)，故MSCs可能通過降低氧化應(yīng)激水平對肺氣腫發(fā)揮治療作用。MSCs對肺氣腫發(fā)病過程中氧化應(yīng)激的影響及其抗氧化應(yīng)激機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

（圖3見插頁）

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（2014-09-26收稿2014-11-05修回）

（本文編輯閆娟）

Mesenchymal stem cells transplantation alleviates pulmonary emphysema and oxidative stress in rat

JIN Zhixian1，BI Hong1，ZHOU Kaihua1，DU Junyi1，CHEN Min1，WANG Qing1△，PAN Xinghua2
1 Respiratory Department Two of The First People's Hospital of Kunming，Kunming 650000，China；2 Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province，Kunming General Hospital of Chengdu Military Command
△Corresponding AuthorE-mail:wangqing87329@126.com；xinghuapan@aliyun.com

ObjectiveTo test the effect of bone marrow mesenehymal stem cells（MSCs）transplantation on oxidative stress and the development of pulmonary emphysema in rats.MethodsSD rats（n=26）were randomly divided into three groups：normal control group（group A，n=8），emphysema group（group B，n=8）and emphysema+MSCs transplantation group （group C，n=10）.Rat models of emphysema was established by exposing rats to cigarette smoking for 14 weeks.Then rats of group C received MSCs transplantation.At the 14thand 28thdays after 4 course of MSCs transplantations，one rat in group C was sacrificed at each time point and their lungs were preserved in frozen sections.Survival of MSCs in the lung tissues were observed by fluorescence microscopy.Eight weeks after transplantations，lung sections were stained by hematoxylin and eo?sin（HE）to observe the morphological alterations.Mean linear intercept（MLI）and mean alveolar numbers（MAN）were also measured.Serum and lung malondialdehyde（MDA）levels and superoxide dismutase（SOD）activity were also examined.Re?sultsAt the 14thday and 28thday after transplantations of MSCs，MSCs successfully localized to lung and survived in rat models of emphysema.Emphysematous changes of lung tissues were observed in both group B and group C.MLI was higher while MAN was lower in group B and C than those in group A（P＜0.05）.MLI and MDA levels in serum and lung were high?er while MAN level and SOD activity were lower in group B than those in group C（P＜0.05）.MDA levels in serum and lung was higher while SOD activity was lower in group B and C than those in group A（P＜0.05）.ConclusionMSCs transplanta?tions can effectively alleviates pulmonary emphysema in rat models which might through reducing oxidative stress.

pulmonary emphysema；mesenchymal stem cells；oxidative stress；mesenchymal stem cell transplantation

R563.3

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.003

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目資助（2012FB106）

1昆明市第一人民醫(yī)院呼吸二科（郵編650011）；2云南省干細(xì)胞工程實驗室，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院

金志賢（1970），女，主任醫(yī)師，學(xué)士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究

△E-mail：wangqing87329@126.com；xinghuapan@aliyun.com