前列腺素E2緩釋微球?qū)Τ晒菢蛹?xì)胞株MC3T3-E1生物學(xué)性能的影響

白艷潔， 徐 暉， 張 揚(yáng)

前列腺素E2緩釋微球?qū)Τ晒菢蛹?xì)胞株MC3T3-E1生物學(xué)性能的影響

白艷潔， 徐 暉， 張 揚(yáng)

目的 探討載前列腺素E2(PGE2)的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球(PGE2- MSs)的藥物緩釋作用和對成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1生物學(xué)性能的影響。方法 采用膜乳化法制備粒徑均勻的PGE2-MSs，用酶聯(lián)免疫分析法測定微球的載藥量和體外藥物釋放。以無添加物培養(yǎng)基作為空白對照，PGE2和PGE2-MSs(0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8 μmol/L)為實(shí)驗(yàn)組，與MC3T3-E1細(xì)胞株孵育，分別于不同時(shí)間用MTT法檢測MC3T3-E1細(xì)胞株增殖活性、堿性磷酸酶試劑盒檢測樣本的A值，并用顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)制備的PGE2-MSs粒徑約5 μm，且粒徑分布窄；PLGA(IV=0.28)為載體材料的微球載藥量為2.5%，48 h藥物累積釋放量約80%。PGE2-MSs在第2、3、4天的MTT吸光值，第3、5、7天的堿性磷酸酶分泌量，第7、9、11、15天的礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)GE2-MSs體外具有明顯的緩釋PGE2特征，對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化、成骨作用的影響具有時(shí)間和劑量依賴性。

前列腺素E2； 緩釋微球； 成骨樣細(xì)胞； 生物學(xué)性能

乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種生物降解型高分子材料，毒性低，安全性高，生物相容性良好。PLGA是少數(shù)取得美國FDA批準(zhǔn)的藥物載體材料，并已逐步用于臨床[1]、組織工程支架[2]和藥物載體[3-4]。前列腺素E2(PGE2)是最主要的PGE化合物,活性強(qiáng)，體內(nèi)含量少，局部合成、釋放、滅活，半衰期極短(1～2 min，K Fuller, 1989年)。其主要由成骨細(xì)胞合成，直接與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞作用,亦可與骨髓細(xì)胞間接作用,通過增加破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的募集介導(dǎo)骨吸收和骨形成作用。在正畸過程中，支抗控制是決定正畸成功的關(guān)鍵。如何利用PGE2低濃度促進(jìn)成骨的特性增加成骨，以控制支抗，需要緩釋PGE2。自2013年5月至2015年2月，我們構(gòu)建了PLGA微球負(fù)載PGE2，通過藥物包封率、緩釋曲線的實(shí)驗(yàn)研究，確定載體的性質(zhì)，并應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)干預(yù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

pHS-2C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)；S3400掃描電子顯微鏡)(日本HITACHI公司)；膜乳化器和SPG膜(日本SPG TECHNOLOGY公司)；FDU-2110冷凍干燥機(jī)(日本EYELA公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)；Tecan Sunrise型酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)；乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA50/50，IV=0.28和PLGA50/50 IV=0.67，Absorbable Polymers International，美國)；聚乙烯醇217(上?？蓸符悋H貿(mào)易有限公司)；乙酸乙酯(天津博迪化工有限公司)；大鼠PGE2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(北京方程生物科技有限公司)；PGE2(武漢三洹醫(yī)藥化工有限公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALD)試劑盒(日本W(wǎng)AKO公司)；MTT、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Triton-X100(美國SIGMA公司)等。小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14細(xì)胞株(MC3T3-E1 Subclone 14)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫(ATCC CRL-2594)，由中國醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心一部傳代保存。

1.2 PGE2-MSs的制備和性質(zhì)

1.2.1 PGE2-MSs的制備 用膜乳化法制備PLGA微球。稱取6 mg PGE2和200 mg PLGA，溶于4 ml乙酸乙酯(油相)；將油相加入30 ml 1%PVA水溶液(水相)中，4000 r/min高速剪切分散1 min，獲得初乳；將初乳加入膜乳化器(SPG)中， 7.0～8.0 PSI壓力下將初乳完全擠出，獲得均勻的乳液，補(bǔ)加1%PVA水溶液30 ml，45 ℃下減壓蒸發(fā)20 min，除去有機(jī)溶劑，獲得固化的微球；反復(fù)離心-水洗3次，冷凍干燥；干燥微球噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察。ELISA法測定PGE2的載藥量(DL，wt%)

1.2.2 PGE2-MSs的體外藥物釋放度 參照文獻(xiàn)[5]用乙醇-PBS pH 7.4溶液(V乙醇：VPBS=1∶1)作為釋放介質(zhì)，“直接釋藥法”考察微球的體外藥物釋放。精密稱取PGE2-MSs 2 mg，置5 ml離心管中，加入4 ml釋放介質(zhì)，置(37±0.5)℃恒溫水浴搖床中，100 r/min振蕩，分別于3、6、9、12、24、48 h取釋放介質(zhì)3 ml，立即補(bǔ)加3 ml釋放介質(zhì)。樣品8000 r/min離心5 min，取上清液測定PGE2含量。采用大鼠PGE2酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定PGE2含量，檢測范圍為20～400 ng/ml。

1.3 PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞株生物性能的影響

1.3.1 成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的培養(yǎng) 將小鼠MC3T3-E1細(xì)胞按3×105/ml培養(yǎng)于含有100 ml細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，對數(shù)生長期時(shí)傳代，之后凍存、復(fù)蘇，再接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶并置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞株增值的影響

將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞用0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA消化收集后，加入10%FBS的MEM培養(yǎng)液制成2×104/ml細(xì)胞懸液加于96孔微量培養(yǎng)板中，每孔0.1 ml，待細(xì)胞鋪滿孔底后，分別取不同濃度(0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8 μmol/L)PGE2、空白微球和PGE2- MSs加于96孔培養(yǎng)板中，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。分別于24、48、72 h后取出，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；待有明顯的紫色甲臜顆粒出現(xiàn)時(shí)，充分吸除上清液，每孔加DMSO 100 ml終止反應(yīng)，將培養(yǎng)板放在平板搖床上振蕩10 min；待紫色甲臜顆粒充分溶解后，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在A570波長處分別測定其OD值。

1.3.3 PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞株分泌ALP的影響 細(xì)胞培養(yǎng)同上，分別于3、5、7 d后取出，吸去舊的培養(yǎng)液，用無菌PBS液反復(fù)沖洗貼壁3次并加入胰蛋白酶消化后，再次加入MEM終止消化；吸入離心管中，放入離心機(jī)，以1000 r/min離心5 min，棄上清液，每管加入200 μl 2%的Trition-100,4 ℃冰箱裂解細(xì)胞12 h并反復(fù)吹打數(shù)次后，以1000 r/min離心10 min。每孔取5 μl上清液，按照ALP試劑盒的要求操作，于520 nm波長的紫外分光光度計(jì)下測定A值。

1.3.4 PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞株基質(zhì)礦化程度的影響 將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化收集后，加入10%FBS的MEM培養(yǎng)液制成2×105/ml細(xì)胞懸液加于24孔培養(yǎng)板；每孔1 ml,待細(xì)胞鋪滿孔底后，分別取用OriCellTM小鼠成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液稀釋的不同濃度(同前)PGE2、PGE2-MSs和空白微球加于24孔培養(yǎng)板中，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)鈣化。每2 d換液1/2。分別于第7、 9、 11、 13天取出，用95%乙醇原位固定10 min,0.1%茜素紅染色(ARs)30 min,流水沖洗10 min。低倍(×20)光鏡下觀察并攝影,每孔隨機(jī)取4個(gè)視野, 采用雙盲法計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，計(jì)算每孔 4個(gè)視野計(jì)數(shù)之和。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PGE2-MSs的制備和性質(zhì)

PGE2-MSs的粒徑和載藥量測定結(jié)果見表1，掃描電鏡照片見圖1。PGE2-MSs呈規(guī)則球形，表面光滑，采用膜乳化技術(shù)制備的微球，平均粒徑約為5 μm，且粒徑分布窄。PGE2-MSs顯示出明顯的體外藥物緩釋作用，但以高分子量PLGA(IV=0.67)為載體材料的微球，在經(jīng)過初期的突釋階段后，藥物釋放量不再增加。以低分子量PLGA(IV=0.28)為載體材料的微球，具有持續(xù)的藥物緩釋效果(圖2)，48 h藥物累積釋放量接近80%。從治療的角度考慮，后者的釋放效果更理想。

表1 PGE2-MSs的粒徑和載藥量

2.2 PGE2-MSs對小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1生物性能的影響

2.2.1 PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞株增殖的影響與對照組(0濃度PGE2-MSs、空白對照)相比，0.0125、0.05 μmol/L PGE2-MSs，對MC3T3-E1細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用(P<0.05)；而濃度為0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L的PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞增殖具有抑制作用(P<0.05)，且呈劑量依賴性；PGE2-MSs的促進(jìn)作用大于等濃度PGE2，抑制作用低于等濃度PGE2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在48、72h，則與相同濃度的PGE2的促進(jìn)或抑制作用無顯著性差異。

2.2.2PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞株分泌ALP的影響 各種濃度的PGE2、PGE2-MSs在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均對MC3T3-E1細(xì)胞分泌ALP具有促進(jìn)作用(P<0.05)，且具有劑量依賴性(除外0.0125μmol/L濃度的PGE2-MSs在3d時(shí)對MC3T3-E1細(xì)胞分泌ALP無影響)。等濃度兩組比較，第3天時(shí)，PGE2的促進(jìn)作用大于PGE2-MSs(P<0.05)；第5天時(shí)，對ALP的分泌影響達(dá)到高峰，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天時(shí)，ALP分泌開始下降，但PGE2-MSs促進(jìn)作用大于等濃度PGE2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并出現(xiàn)隨時(shí)間延長而差異增大趨勢。

2.2.3PGE2-MSs對小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1基質(zhì)礦化程度的影響 不同濃度的PGE2-MSs(0.0125、0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L)在第7天時(shí)，對MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化的促進(jìn)作用低于相同濃度的PGE2(P<0.05)，而第9天時(shí)，則略高于相同濃度的PGE2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而第11、15天時(shí)對MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化的促進(jìn)作用高于相同濃度的PGE2(P<0.05)。提示各種濃度的PGE2-MSs對MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化具有促進(jìn)作用，且具有劑量依賴性。見圖3。

3 討論

目前,大部分PLGA微球均采用乳化分散法和相分離凝聚法制備。其中相分離法適合于水溶性藥物微球的制備，乳化分散法對水溶性、脂溶性藥物均適宜。溶劑揮發(fā)法是乳化分散法中常用的制備方法之一[6]。但對水溶性藥物往往包封率低[7]。本實(shí)驗(yàn)由于PGE2為非水溶性藥物的理化性質(zhì)，所以采用膜乳化法制備PLGA微球，能獲得理想的載藥率和包封率，且所制得微球的粒徑均勻。

微球中藥物的釋放有2種機(jī)制[8]：⑴擴(kuò)散機(jī)制。藥物由進(jìn)入微球的溶液溶解后經(jīng)微球的孔隙擴(kuò)散到介質(zhì)中，微球表面藥物的溶解及擴(kuò)散可形成釋藥的突釋效應(yīng)。⑵降解機(jī)制。聚合物降解成為體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，可使藥物釋放。本實(shí)驗(yàn)釋藥結(jié)果表明：PGE2/PLGA微球中的PGE2釋放符合雙相動力學(xué)釋藥規(guī)律，即初相為快速釋藥相，后相為緩釋相。這種釋藥特點(diǎn)可以使局部形成有效濃度并維持下去，本實(shí)驗(yàn)48 h體外釋藥率接近80%。本實(shí)驗(yàn)觀察了PGE2-MSs的緩釋作用，由于具體時(shí)間的緩釋濃度累積及代謝量無法精確控制，故設(shè)計(jì)緩釋微球的終釋放量等于PGE2組的起始濃度，即PGE2-MSs組起始濃度低于PGE2組。在觀察增殖實(shí)驗(yàn)24 h時(shí)，將PGE2組與PGE2-MSs組等濃度比較OD值有顯著性差異，PGE2組增殖作用強(qiáng)于PGE2-MSs組；48、72 h二者達(dá)到相近的增殖狀態(tài)；在觀察細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)3 d，PGE2組與PGE2-MSs組等濃度比較，A值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PGE2組分化作用強(qiáng)于PGE2-MSs組，5 d后，二者達(dá)到相近的分化狀態(tài)，而第7天時(shí)，PGE2-MSs組促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用強(qiáng)于PGE2組；在觀察礦化實(shí)驗(yàn)7 d，PGE2組促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的作用強(qiáng)于PGE2-MSs組，第9天濃度為 0.0125、0.05μmol時(shí)PGE2組促進(jìn)礦化作用強(qiáng)于PGE2-MSs組，而第11天時(shí)結(jié)果出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，0.8、3.2、12.8 μmol/L濃度時(shí)PGE2-MSs組促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的作用強(qiáng)于PGE2組；15 d且濃度為0.05、0.2、0.8、3.2 μmol/L時(shí)，PGE2-MSs促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的作用明顯強(qiáng)于PGE2。以上結(jié)果清晰地展現(xiàn)了PGE2-MSs載體隨時(shí)間變化呈現(xiàn)作用增強(qiáng)的趨勢。因此我們推測，PGE2-MSs在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有緩釋作用，影響成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化。二者在0.0125、12.8 μmol/L濃度，第15天時(shí)對礦化影響接近一致，提示本實(shí)驗(yàn)PGE2-MSs的最長緩釋時(shí)間為15 d。關(guān)于PLGA為載體材料的PGE2-MSs的研究，國外僅有少量報(bào)道[9]，PGE2作為組織工程研究的靶分子，通過載體可以改變其半衰期。因此，PLGA-PGE2作為組織工程的優(yōu)良藥物釋放系統(tǒng)，必將吸引更多學(xué)者的關(guān)注。

圖1 PGE2-MSs的掃描電子顯微鏡照片 a. 空白微球 b. PLGA50/50，IV=0.28 c. PLGA50/50，IV=0.67 圖2 PGE2-MSs的體外藥物釋放曲線 圖3 PGE2-MSs對成骨細(xì)胞基質(zhì)礦化的影響 a.7 d b.9 d c.11 d d.15 d
Fig 1 Electron micrograph of PGE2-MSs. a. blank microspheres. b. PLGA50/50, IV=0.28. c. PLGA50/50, IV=0.67. Fig 2 drug release profiles of PGE2-MSs in vitro. Fig 3 Effect of PGE2-MSs on osteoblast mineralization a. 7days b. 9 days c. 11 days d. 15 days

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Effect of sustained release microspheres from prostaglandin E2 on the biologic properties of osteoblast-like cell line MC3T3-E1

BAIYan-jie,XUHui,ZHANGYang.

(DepartmentofOrthodontics,DentalHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110002,China)

Objective To investigate the drug release of prostaglandin E2 (PGE2)loaded on lactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA) microspheres (PGE2-MSs) and the drug effects on the biological properties of osteoblast-like cell line MC3T3. Methods PGE2-MSs in uniform size were prepared by using membrane emulsification, the entrapment efficiency of the microspheres and drug release in vitro were detected by enzyme-linked immunosorbent assay method; The experimental groups were added in the medium with PGE2-MSs at different concentrations (0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8 μmol/L)and the blank control was added without any additives. All were incubated with MC3T3-E1 cell line. The proliferative activity of MC3T3-E1 cell line was detected by MTT assay at different times and the A valuation was measured by alkaline phosphatase kit, and then the number of mineralized nodules in each perspective were counted under a microscope. Results The prepared PGE2 MSs was in about 5 μm size with narrow particle size distribution; the entrapment efficiency of the microsphere prepared from PLGA (IV=0.28) was 2.5%, cumulative emissions at 48 h were about 80%; MTT absorbance value at 2, 3 and 4 days, the secretion levels of alkaline phosphatase at 3,5 and 7 days, the number of mineralized nodule at 7, 9, 11 and 15 days were significantly different compared with the control groups (P<0.05). Conclusion PGE2-MSs possess obviously the characteristic of sustained release of PGE2 in vitro, and have a influence on proliferation, differentiation and ossification of MC3T3-E1 by the time and dose-dependent manner.

Prostaglandin E2; Sustained release microspheres; Osteoblast-like cell; Biological properties

110002 遼寧 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科(現(xiàn)遼寧省人民醫(yī)院 口腔科：白艷潔)；沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院 藥劑系(徐 暉)；中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科(張 揚(yáng))

白艷潔(1967-)，女，遼寧沈陽人，主任醫(yī)師，博士研究生.

張 揚(yáng)，110002，中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科，電子信箱：yz1958cmu@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.015

R

A

1673-7040(2015)04-0235-04

2015-03-06)