氮脅迫下小球藻淀粉與脂肪的合成關(guān)系

王亞杰，朱順妮，王忠銘，袁振宏

（1 中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，中國(guó)科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640； 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039）

引 言

近年來(lái)微藻作為生物燃料已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。脂肪和淀粉是微藻細(xì)胞中兩種重要的儲(chǔ)能物質(zhì)[1-2]。研究表明：在環(huán)境脅迫時(shí)，如缺氮、高光、高鹽的情況下，微藻細(xì)胞進(jìn)行儲(chǔ)能，促進(jìn)這些物質(zhì)合成[3]。

微藻中脂肪和淀粉的合成途徑如圖1所示，二氧化碳經(jīng)過(guò)卡爾文循環(huán)產(chǎn)生 3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-P），在淀粉合成途徑中，3-磷酸甘油醛再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-P）和葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-P）。之后由關(guān)鍵酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化轉(zhuǎn)化成ADP-葡萄糖，再經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)催化成淀粉[4]。在脂肪合成途徑中，3-磷酸甘油醛通過(guò)糖酵解途徑生成丙酮酸（pyruvate），之后被第一個(gè)關(guān)鍵限速酶乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化生成丙二酰輔酶A，再經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最終合成脂肪[5-7]。

圖1 脂肪和淀粉合成途徑Fig.1 Lipid and starch synthesis pathway

由此可見(jiàn)，微藻中淀粉的合成與脂肪的合成擁有共同的前體物質(zhì)3-磷酸甘油醛，有可能存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。已有研究表明[8-9]在植物中淀粉和脂肪的合成途徑存在相互關(guān)系，但它們之間的調(diào)控機(jī)制還不清楚。如油菜胚胎的淀粉合成受到抑制會(huì)導(dǎo)致脂肪的合成速率減慢，最終成熟種子中的總脂肪含量沒(méi)有明顯改變[9]。然而通過(guò)失活淀粉分支酶導(dǎo)致不產(chǎn)淀粉的豌豆Pisum sativum突變體卻可以顯著提高種子的脂肪含量。在微藻中，這方面的研究較缺乏，且主要集中在模式生物Chlamydomonas reinhardtti。Wang 等[10]和Li 等[11]分別報(bào)道了不產(chǎn)淀粉的突變?cè)逯闏.reinhardtiiBAFJ5 在缺氮后含油量比野生型有明顯增加。這些研究表明淀粉和脂肪合成之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下小球藻Chlorellasp.快速積累淀粉作為短期應(yīng)急響應(yīng)，而隨著氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，小球藻轉(zhuǎn)而積累能量密度更高的脂肪作為長(zhǎng)期儲(chǔ)能物質(zhì)[1-2]，但是這兩者的關(guān)系還不清楚。因此本文在前期研究的基礎(chǔ)上，在氮脅迫的條件下分別添加淀粉合成途徑關(guān)鍵酶AGPase 的抑制劑Pi（無(wú)機(jī)磷酸鹽）[12-13]或脂肪合成途徑關(guān)鍵酶ACCase 的特異性抑制劑稀禾定[14]，原位解析小球藻淀粉和脂肪之間的相互關(guān)系。研究結(jié)果可以為調(diào)控微藻脂肪和淀粉合成提供理論指導(dǎo)[15]，對(duì)微藻生物燃料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用有著至關(guān)重要的意義。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

小球藻Chlorellasp.保存在BG-11 培養(yǎng)基中。反應(yīng)器采用柱狀玻璃管（裝液量為1 L），培養(yǎng)溫度約 25 ℃，24 h 連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為 150 μmol·m-2·s-1，在反應(yīng)器底部持續(xù)通入富加CO2（1%，體積比）的壓縮空氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 淀粉合成的抑制實(shí)驗(yàn) 將種子液在BG-11 培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)4 d 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，分別接種至對(duì)照組（缺氮培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（缺氮培養(yǎng)基加入5 mmol·L-1Pi）中，初始OD750約為0.8，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，連續(xù)培養(yǎng)6 d，第0、1、2、4、6 d取樣。

1.2.2 脂肪合成的抑制實(shí)驗(yàn) 將種子液在BG-11 培養(yǎng)基中通氣培養(yǎng)4 d 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，分別接種至對(duì)照組（缺氮培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（缺氮培養(yǎng)基加40 μmol·L-1稀禾定）中，初始OD750約為0.8，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，在氣升光反應(yīng)器中通入富加CO2的壓縮空氣（1% CO2），培養(yǎng)溫度24℃，24 h 連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1。連續(xù)培養(yǎng)6 d，第0、1、2、4、6 d 取樣。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，測(cè)定指定天數(shù)的藻細(xì)胞干重、細(xì)胞計(jì)數(shù)。

藻細(xì)胞干重：取10 ml 藻液抽濾，于80℃烘箱烘至恒重，冷卻后稱(chēng)重。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：取少量樣品，加至血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下讀取25 個(gè)4×4 格中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，進(jìn)行計(jì)算，以107cells·ml-1為單位計(jì)數(shù)。

1.4 淀粉的測(cè)定

稱(chēng)取2～4 mg 藻粉，裝入10 ml 玻璃離心管中，向玻璃離心管中加入0.25 ml 超純水和約0.5 ml 的酸洗玻璃珠，在2700 r·min-1下渦旋4 min，進(jìn)行破壁。加入4 ml 濃度為80%乙醇溶液和轉(zhuǎn)子(直徑10 mm)，于68℃水浴15 min。水浴后4000 r·min-1離心6 min 去上清，去除色素，重復(fù)3 次。加入3.3 ml 30%高氯酸溶液，在25℃下攪拌15 min。攪拌后4000 r·min-1離心6 min，取上清裝入10 ml 容量瓶中，淀粉充分水解，重復(fù)3 次。定容至10 ml[16]。采用苯酚-硫酸法測(cè)定淀粉含量[17]。

1.5 脂肪的測(cè)定

本研究使用一步提取+酯交換反應(yīng)[18]來(lái)進(jìn)行微藻中脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為FAMEs，并結(jié)合氣相色譜對(duì)FAME進(jìn)行定量。具體方法如下。

藻粉中加入2.5 ml 含2%硫酸的甲醇溶液，80℃下攪拌加熱2.5 h 完成脂肪酸的甲酯化。樣品冷卻至室溫后加入1 ml 飽和NaCl 溶液和1 ml 正己烷，振蕩后靜置分層，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾，加入正十七烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，定容1 ml。脂肪酸甲酯利用島津GC2010 氣相色譜進(jìn)行定量分析，檢測(cè)器為FID。升溫程序?yàn)椋?90℃保持5 min，以10℃·min-1升溫至250℃，再保持7 min。色譜柱為：DB-WAX，厚度0.25 μm，長(zhǎng)度30 m，內(nèi)徑0.25 μm。

脂肪酸甲酯標(biāo)樣為購(gòu)自Sigma 公司正十七烷酸甲酯。

2 結(jié)果與討論

2.1 淀粉途徑被抑制

2.1.1 Pi 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 小球藻Chlorellasp.在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。小球藻Chlorellasp.初始濃度為0.21 g·L-1，在對(duì)照組缺氮培養(yǎng)下，到第4 d 時(shí)生物量達(dá)到0.70 g·L-1，之后增長(zhǎng)放緩，第6 d 生物量達(dá)到0.80 g·L-1，生物量總共增長(zhǎng)了4 倍。實(shí)驗(yàn)組缺氮加Pi 條件培養(yǎng)下，第4 d 時(shí)生物量可達(dá)到0.75 g·L-1，之后增長(zhǎng)放緩，第6 d 生物量達(dá)到0.82 g·L-1，生物量總共增長(zhǎng)了4.1 倍，生物量相比對(duì)照組變化不明顯，但總體生長(zhǎng)趨勢(shì)較對(duì)照組好。對(duì)照組細(xì)胞個(gè)數(shù)接種時(shí)為1.56(107cells)·ml-1，第2 d 達(dá)到4.77(107cells)·ml-1，之后增長(zhǎng)緩慢甚至略有下降，第 6 d 為5.49(107cells)·ml-1。實(shí)驗(yàn)組在第 2 d 達(dá)到4.90(107cells)·ml-1，之后增長(zhǎng)緩慢甚至略有下降，第6 d 為5.91(107cells)·ml-1。細(xì)胞個(gè)數(shù)在第2 d 后緩慢增長(zhǎng)甚至略有下降，較對(duì)照組而言5 mmol·L-1Pi 可促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng)，這與Xie 等[19]、Vezie 等[20]的研究報(bào)道相一致。

圖2 小球藻在對(duì)照組和添加Pi 抑制劑條件下 生物量及細(xì)胞個(gè)數(shù)曲線Fig.2 Curves of dry weight(DW),cell number (CN) in Chlorella sp.under control and (-N+Pi) conditions

2.1.2 Pi 對(duì)淀粉合成的影響 小球藻Chlorellasp.在對(duì)照和缺氮加Pi 條件下淀粉濃度和單位細(xì)胞淀粉含量隨時(shí)間的變化如圖3所示。在對(duì)照組，淀粉濃度在第1 d 迅速升高，從初始的30 mg·L-1達(dá)到154 mg·L-1。第2 d 有一個(gè)小的增幅達(dá)178 mg·L-1，之后開(kāi)始略微下降到第6 d 達(dá)154 mg·L-1。對(duì)比加Pi組，淀粉濃度在第1 d 也是迅速升高到162 mg·L-1。第2 d 略有升高之后開(kāi)始緩慢下降，第6 d 達(dá)到138 mg·L-1[圖3(a)]。對(duì)照單位細(xì)胞淀粉含量第1 d 從19.4 μg·(107cells)-1達(dá)到32.3 μg·(107cells)-1，第2 d 略微增加然后開(kāi)始下降，到第6 d 達(dá)到27.8 μg·(107cells)-1。實(shí)驗(yàn)組單位細(xì)胞淀粉含量第1 d 迅速增至33 μg·(107cells)-1，第2 d 略微增加然后開(kāi)始下降，到第6 d 達(dá)到22.7 μg·(107cells)-1[圖3(b)]。對(duì)比Chlorellasp.在兩種條件下的變化，加入Pi 以后，在前2 d 淀粉濃度變化不明顯，淀粉濃度在第2、4、6 d 分別降低了3%、19%、9%。單位細(xì)胞淀粉含量在2、4、6 d 分別降低了13%、25%、18%。Lloyd 等[21]發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯接種AGPase 可分別與3-磷酸甘油酸（3-PGA）和無(wú)機(jī)磷（Pi）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)AGPase 的活性的調(diào)控，3-PGA 是該酶激活因子，后者是抑制因子，能夠抑制淀粉合成。Li 等[12]的研究結(jié)果表明1 mmol·L-1Pi 即可對(duì)Pseudochlorococcumsp.的AGPase 酶活性產(chǎn)生顯著影響，能明顯抑制淀粉的合成。

圖3 小球藻在對(duì)照條件和加抑制劑(-N+Pi)條件下淀粉濃度（a）和單位細(xì)胞淀粉含量（b）的變化Fig.3 Variations of starch in culturesChlorella sp.under control and (-N+Pi) conditions

2.1.3 Pi 對(duì)脂肪合成的影響 小球藻Chlorellasp.在對(duì)照和缺氮加Pi 條件下脂肪酸濃度和單位細(xì)胞脂肪酸含量隨時(shí)間的變化如圖4所示。對(duì)照條件下，脂肪酸濃度呈現(xiàn)一直增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在對(duì)照組，脂肪 酸濃度從初始28 mg·L-1到第6 d 達(dá)到191 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)組脂肪酸濃度在第6 d 達(dá)到197 mg·L-1[圖4(a)]。對(duì)照組單位細(xì)胞脂肪酸含量從初始的18.2 μg·(107cells)-1達(dá)到34.9 μg·(107cells)-1。加了抑制劑Pi 的實(shí)驗(yàn)組，單位細(xì)胞脂肪酸含量在第6 d 達(dá)到32.4 μg·(107cells)-1[圖4(b)]。

對(duì)比Chlorellasp.在兩種條件下的淀粉和脂肪酸含量變化，表明在本實(shí)驗(yàn)期(6 d)Pi 抑制淀粉合成的同時(shí)并沒(méi)有同時(shí)促進(jìn)脂肪的積累。Siaut 等[22]對(duì)Chlamydomonas reinhardtii的研究結(jié)果表明，不產(chǎn)淀粉的突變?cè)逯闏W15 sta1-2 等在缺氮后TAG 含量較野生型并沒(méi)有明顯增加，反而降低了。Li 等[12]對(duì)Pseudochlorococcumsp.的研究表明，加入 1 mmol·L-1的Pi 后AGPase 酶活性第2 d 降低了39.2%，對(duì)淀粉的合成有明顯的抑制作用，同時(shí)也導(dǎo)致脂肪含量的降低。但是Chlorella pyrenoidosa82T 通過(guò)紫外誘變獲得的不產(chǎn)淀粉的突變株，在缺氮條件下積累脂肪酸的含量明顯高于野生型[23]。要想更準(zhǔn)確地解析抑制淀粉途徑對(duì)脂肪酸途徑的影響，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

圖4 小球藻在對(duì)照和添加抑制劑(-N+Pi)條件下脂肪酸濃度（a）和單位細(xì)胞脂肪酸含量（b）的變化Fig.4 Variations of total fatty acids（TFA） in culturesChlorella sp.under control and (-N+Pi) conditions

2.2 脂肪途徑被抑制

2.2.1 稀禾定對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 小球藻Chlorellasp.在缺氮和缺氮加稀禾定（sethoxydim）對(duì)比條件下的生長(zhǎng)曲線如圖5所示。小球藻Chlorellasp.初始濃度為0.19 g·L-1，在對(duì)照組，細(xì)胞個(gè)數(shù)和生物量的長(zhǎng)勢(shì)與圖1中的對(duì)照組一致。而在加稀禾定的實(shí)驗(yàn)組條件下，生物量到第4 d 時(shí)已達(dá)到0.7 g·L-1，之后增長(zhǎng)放緩，第6 d 生物量達(dá)到0.74 g·L-1，生物量較對(duì)照組沒(méi)有顯著變化。說(shuō)明40 μmol·L-1的稀禾定對(duì)細(xì)胞生物量的積累影響不大。細(xì)胞個(gè)數(shù)在第2 d 后就一直低于對(duì)照組，到培養(yǎng)的第6 d 較對(duì)照組降低了7.3%。結(jié)果顯示，加入稀禾定在一定程度上抑制了細(xì)胞個(gè)數(shù)的增長(zhǎng)，而對(duì)生物量的影響較小。Zhekisheva 等[24]對(duì)Heamatococcus pluvialis的研究 結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 μmol·L-1和50 μmol·L-1稀禾定對(duì)微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

圖5 小球藻在對(duì)照組和添加稀禾定抑制劑條件下 生物量及細(xì)胞個(gè)數(shù)曲線Fig.5 Curves of dry weight(DW),cell number(CN) in Chlorella sp.under control and (-N+XHD) conditions

圖6 小球藻在對(duì)照和添加抑制劑稀禾定條件下脂肪酸濃度（a）和單位細(xì)胞脂肪酸含量（b）的變化Fig.6 Variations of total fatty acids（TFA） in culturesChlorella sp.under control and (-N+XHD) conditions

2.2.2 稀禾定對(duì)脂肪合成的影響 有研究表明，稀禾定直接作用位點(diǎn)是ACCase 的羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)功能域[25]。ACCase 是脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶，可以作為稀禾定的靶標(biāo)位點(diǎn)[14,26]。所以，稀禾定能在一定程度上抑制脂肪酸的合成。加入稀禾定后脂肪酸含量的變化趨勢(shì)如圖6所示。前4 d 與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，第6 d 相比對(duì)照組脂肪酸濃度降低了18.8%，單位細(xì)胞的脂肪酸含量降低了13.4%。由于缺氮條件下脂肪合成速率較慢[1]，稀禾定對(duì)脂肪酸合成的抑制到后期才表現(xiàn)出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，40 μmol·L-1的稀禾定能夠在一定程度上抑制脂肪的合成。Zhekisheva 等[24]對(duì)Heamatococcus pluvialis加入10～50 μmol·L-1稀禾定的研究結(jié)果顯示稀禾定能夠很好地抑制脂肪酸的合成，尤其是中性脂（NL）的合成。

圖7 小球藻在對(duì)照和添加稀禾定抑制劑條件下淀粉濃度（a）和單位細(xì)胞淀粉含量（b）的變化Fig.7 Variations of starch in culturesChlorella sp.under control and (-N+ XHD) conditions

2.2.3 稀禾定對(duì)淀粉合成的影響 小球藻Chlorellasp.在加入稀禾定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，淀粉合成的變化趨勢(shì)如圖7所示。與對(duì)照組相比淀粉合成趨勢(shì)相同，都是前2 d 增長(zhǎng)迅速，第2 d 以后緩慢增長(zhǎng)甚至略有下降。對(duì)照組第2 d 淀粉濃度和單位細(xì)胞淀粉含量分別是229 mg·L-1和43 μg·(107cells)-1。加入稀禾定的實(shí)驗(yàn)組，第2 d 淀粉濃度和單位細(xì)胞淀粉含量分別是200 mg·L-1和41 μg·(107cells)-1。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，抑制脂肪途徑對(duì)淀粉無(wú)明顯作用，可能因?yàn)榈矸凼强焖俜e累的產(chǎn)物，脂肪是一個(gè)長(zhǎng)期緩慢積累的產(chǎn)物。這與Recht 等[18]對(duì)Haematococcus pluvialis的研究結(jié)果相似，他們用蘋(píng) 果酸脫氫酶特異性抑制劑芝麻酚成功抑制了脂肪酸的合成，總糖濃度也略有降低，碳水化合物含量（占干重的百分比）并沒(méi)有顯著影響。

3 結(jié) 論

（1）缺氮條件下加入Pi 能在一定程度上促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，對(duì)淀粉的合成具有明顯的抑制效應(yīng)，脂肪酸濃度有所增長(zhǎng)，但對(duì)單位細(xì)胞脂肪酸含量的促進(jìn)效應(yīng)不是很明顯。

（2）缺氮條件下加入稀禾定對(duì)小球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，對(duì)脂肪酸的合成只在第6 d開(kāi)始受到明顯抑制，淀粉濃度降低，但單位細(xì)胞淀粉含量無(wú)顯著影響，可能是由于稀禾定抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)導(dǎo)致的。

（3）小球藻淀粉和脂肪的合成可能并不是簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，抑制一方的合成似乎并不能促進(jìn)另一方合成的增強(qiáng)，需要更進(jìn)一步的研究。

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