性別控制技術(shù)的研究進(jìn)展及在工作犬繁育中的應(yīng)用

張匯東 高一龍 溫 海

性別控制是指通過(guò)對(duì)動(dòng)物的正常生殖過(guò)程進(jìn)行人為干預(yù)、能使成年雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別后代的生物技術(shù)，對(duì)家畜育種、生產(chǎn)性能提高和遺傳疾病的預(yù)防有非常重要的作用。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外性別控制技術(shù)主要有兩種途徑：X/Y精子的分離和胚胎的性別鑒定。其中流式細(xì)胞儀分離X/Y精子法，是在受精之前就可以控制人們所需性別后代的一種技術(shù)，是當(dāng)前控制性別最有效的方法，其性別控制準(zhǔn)確率可以達(dá)到90%左右，已在畜牧業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生了明顯的經(jīng)濟(jì)效益。本文簡(jiǎn)述了哺乳動(dòng)物性別控制的原理以及技術(shù)方法，并結(jié)合犬X/Y精子分離實(shí)驗(yàn)的科學(xué)研究進(jìn)展，展望了該技術(shù)在工作犬繁育中的應(yīng)用前景。

一、性別控制的方法

（一）X/Y精子分離法控制性別

目前主要根據(jù)X、Y 精子的物理學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)差異進(jìn)行分離，主要有：以X、Y精子DNA含量差異為基礎(chǔ)的流式細(xì)胞儀分離法； 以精子所帶電荷性質(zhì)為基礎(chǔ)電泳分離法；以精子比重大小差異為基礎(chǔ)的沉降分離法；以Y精子特有抗原為基礎(chǔ)的免疫分離法等。

1.流式細(xì)胞儀精子分離技術(shù)

（1）流式細(xì)胞儀精子分離法的發(fā)展

流式細(xì)胞檢索儀問(wèn)世于20世紀(jì)60年代， 起初主要應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究。Gledhill等首先利用流式細(xì)胞儀測(cè)定精子的DNA含量，1989年Johnson等報(bào)道用流式細(xì)胞儀成功地分離得到兔子活的X和Y精子并通過(guò)手術(shù)方法人工授精產(chǎn)下后代。此后，其它動(dòng)物(牛、羊、豬等)的活精子相繼分離成功，并用分離的精子通過(guò)各種途徑，如AI（人工授精)、IVF（體外受精)、ICSI（細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射)等產(chǎn)下了預(yù)知性別的后代。

（2）流式細(xì)胞儀分離精子的原理

哺乳動(dòng)物中通常情況下X染色體較Y染色體大,所以X精子的DNA含量也會(huì)高于Y精子。一般認(rèn)為,當(dāng)動(dòng)物的X精子和Y精子的DNA含量差異大于3.5%時(shí),就能用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離。研究證明，X精子和Y精子DNA含量差異越大的物種越容易分離，犬的X精子和Y精子DNA含量的差異為3.9%,理論上可以通過(guò)分離精子進(jìn)行性別控制。

流式細(xì)胞儀分離技術(shù)采用熒光素Hochest33342對(duì)精子進(jìn)行染色，由于X精子的DNA含量高于Y精子,所以在激光照射下發(fā)出的熒光也比Y精子強(qiáng)，通過(guò)X精子和Y精子分離儀光電信號(hào)的相互轉(zhuǎn)變,使活力旺盛的X精子和Y精子得到有效分離,而活力差以及畸形的精子在分離過(guò)程中被剔除,并通過(guò)人工授精、體外受精等技術(shù),使雌性動(dòng)物產(chǎn)下預(yù)知性別的后代。

（3）流式細(xì)胞儀分離精子的應(yīng)用

英國(guó)的Cogent公司于2000年首先開(kāi)始將性別分離精子投入商業(yè)使用，為其下屬牧場(chǎng)主提供奶牛分離精子的服務(wù)。目前已有包括美國(guó)、中國(guó)、加拿大、墨西哥、阿根廷等國(guó)家相繼進(jìn)入精子分離產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用行列。我國(guó)內(nèi)蒙、新疆、黑龍江、廣西等省市自治區(qū)都紛紛引進(jìn)該分離儀器進(jìn)行精子分離試驗(yàn)。

在國(guó)內(nèi)，王建國(guó)等采用流式細(xì)胞分離法獲得的性控凍精對(duì)奶牛進(jìn)行人工授精,母犢出生準(zhǔn)確率為93.3%, 極顯著高于普通凍精的母犢率，高慶華和魏海軍于2006年9月和2007年9月成功分離梅花鹿和馬鹿精液，速度已能達(dá)到每秒分離X、Y精子各4500個(gè)，純度均超過(guò)91%，并且進(jìn)行了直腸把握子宮頸法(對(duì)馬鹿)和內(nèi)窺鏡法(對(duì)梅花鹿)的低劑量?jī)鼍斁囼?yàn),后代的性別比與輸精的X、Y精子純度均高度吻合。隨著流式細(xì)胞檢索儀的改進(jìn)和相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，養(yǎng)牛業(yè)中性控精液已商業(yè)化使用，綿羊、馬和鹿等也開(kāi)始進(jìn)入了實(shí)用階段。

2.沉降分離法

X/Y精子流式分離原理示意圖

沉降法的原理是X精子的比重大于Y精子，因此沉積速率也大于Y精子。在重力的作用下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的沉降，X和Y精子可部分分離。但是X 和Y精子的比重差異較小, 此方法不能完全分離精子，因而效率和準(zhǔn)確率都不高，生產(chǎn)實(shí)踐中很少使用。經(jīng)過(guò)改進(jìn)的密度梯度離心分離法原理和沉降法相同，用離心力取代沉降，但效果仍不足以進(jìn)行商業(yè)應(yīng)用。

3.電泳分離法

X和Y精子表面所帶電荷量不同,在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)速率也有所差別，所以可通過(guò)電泳將X與Y精子分離。但近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 電泳法準(zhǔn)確率不高, 重復(fù)性較差，而且會(huì)對(duì)精子造成比較大的損傷，所以此方法在生產(chǎn)實(shí)踐中也比較少用。

4.免疫學(xué)分離法

免疫法利用免疫反應(yīng)識(shí)別X和Y精子。H-Y抗原只有在Y精子表達(dá),所以可利用H-Y抗原和特異性抗體結(jié)合將兩類(lèi)精子分離。但此方法對(duì)精子處理的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),影響精子活力,應(yīng)用受限。

（二）胚胎鑒定的性別控制方法

1.細(xì)胞學(xué)方法

細(xì)胞學(xué)方法通過(guò)鑒別胚胎細(xì)胞核型來(lái)確定胚胎性別。該方法準(zhǔn)確率非常高，甚至可達(dá)到100%，但由于過(guò)程繁瑣，對(duì)操作人員以及實(shí)驗(yàn)儀器的要求較高等一系列原因，限制了該技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。

2.免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是通過(guò)H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測(cè)胚胎上雄性特異性H-Y抗原, 存在H-Y抗原為雄性, 否則為雌性。常用的檢測(cè)胚胎H-Y抗原的方法是間接免疫熒光法。該方法在準(zhǔn)確率和效率方面有所欠缺，應(yīng)用不廣泛。

3.分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法是隨著分子生物學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)快速發(fā)展而出現(xiàn)的一種通過(guò)檢測(cè)Y染色體上SRY基因來(lái)鑒別動(dòng)物胚胎性別的方法,存在SRY基因?yàn)樾坌? 否則為雌性, 應(yīng)用最多的有DNA 探針?lè)ê蚉CR 擴(kuò)增法。由于分子生物學(xué)方法有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物胚胎性別鑒定中。

二、性別控制技術(shù)在工作犬繁育中的作用和應(yīng)用前景

（一）性別控制在工作犬繁育中的作用

1. 滿足警方在各個(gè)專業(yè)方向?qū)Σ煌詣e警犬的使用需求

在警犬的使用過(guò)程中，由于性別差異，公犬和母犬在兇猛性、嗅覺(jué)靈敏性、訓(xùn)練使用的耐力和持久性等警用性能方面各有特點(diǎn)?；鶎右痪€的使用實(shí)踐證明，雖然母犬在氣味作業(yè)過(guò)程中嗅認(rèn)仔細(xì)程度好于公犬，但公犬體格比母犬高大，兇猛性普遍高于母犬，且公犬在追蹤耐力和作業(yè)持久性等方面優(yōu)于母犬，所以在巡邏、治安防范等領(lǐng)域的基層帶犬民警傾向于挑選公犬進(jìn)行訓(xùn)練、執(zhí)行任務(wù)；母犬性成熟后，平均每年發(fā)情兩次，發(fā)情期間其警用性能普遍下降；在大型安保活動(dòng)中，一只母犬發(fā)情就會(huì)影響到一群執(zhí)行安保任務(wù)的其他警犬（公），不能正常工作。因此，一般而言公犬比母犬更受帶犬民警的歡迎。通過(guò)性別控制無(wú)疑可以增加公犬繁殖比例，以滿足一線帶犬民警的用犬需求。

2.減少伴性遺傳病高危犬系家族后代的患病幾率

目前發(fā)現(xiàn)有很多種犬類(lèi)伴性遺傳病，如與X染色體關(guān)聯(lián)的犬類(lèi)遺傳疾?。貉巡?、重度聯(lián)合免疫缺陷癥、肌肉萎縮癥、漸行性視網(wǎng)膜萎縮等。對(duì)于這些與X染色體關(guān)聯(lián)的伴性遺傳病高危犬群家族，可以采用性別控制技術(shù)，繁殖雌性胎兒，以降低伴性遺傳病高危犬系家族后代的患病的幾率。通過(guò)合理實(shí)施性別控制，可以減少警犬伴性遺傳病發(fā)病幾率，實(shí)現(xiàn)優(yōu)繁優(yōu)育，提高犬群的遺傳素質(zhì)和警用性能。

3. 增加遺傳和表型性別的選擇強(qiáng)度

控制警犬后代的性別比例，可增加選種強(qiáng)度，最大限地發(fā)揮良種公犬的遺傳繁殖潛力，加快優(yōu)質(zhì)種公犬遺傳基因的傳播速度，加快遺傳進(jìn)展。這項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用必將對(duì)優(yōu)質(zhì)種公犬?dāng)U群、優(yōu)化犬群結(jié)構(gòu)、犬群整體警用性能的提高等方面產(chǎn)生重大影響。

（二）工作犬性別控制技術(shù)的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景

雖然國(guó)內(nèi)外現(xiàn)在對(duì)牛、羊、鹿等哺乳動(dòng)物，利用流式細(xì)胞儀分離精子進(jìn)行性別控制技術(shù)的研究開(kāi)展得如火如荼，比如奶牛的性控精液已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。但在犬的性別控制技術(shù)方面，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道，還沒(méi)有成功系統(tǒng)的研究。主要由于犬特殊的生理生殖特性，國(guó)內(nèi)外對(duì)于犬的人工授精、體外受精、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射等技術(shù)還不是很成熟，導(dǎo)致流式細(xì)胞儀分離XY精子的性別控制技術(shù)的應(yīng)用受到了很大限制，但國(guó)內(nèi)外的研究人員還是對(duì)工作犬的流式分選XY精子開(kāi)展了少量實(shí)驗(yàn)研究。

M·A·Meyers等（2007）對(duì)拉布拉多犬的鮮精進(jìn)行了流式細(xì)胞儀分選X/Y精子的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明分離后的X/Y精子的平均純度約為82%, 分離后的Y精子直接進(jìn)行人工授精，實(shí)驗(yàn)?zāi)溉a(chǎn)了5頭仔犬（3公，2母），性控準(zhǔn)確率為60%；Barbara Merlo等（2015）采集了14頭雜種/純種雄性犬的精液，對(duì)其稀釋染色后分離X/Y精子，并研究了分離后冷凍稀釋液的配方以及低溫存儲(chǔ)的流程，結(jié)果表明X/Y精子的分離效果較好，純度可以達(dá)到85%左右，但解凍后的活力只有2.4 ±1.2%，因此還需進(jìn)一步研究流式分離后的冷凍稀釋保護(hù)液的配方以及低溫存儲(chǔ)的流程。

國(guó)內(nèi)也有相關(guān)機(jī)構(gòu)開(kāi)展了此類(lèi)的研究，但截至目前并無(wú)成功系統(tǒng)研究的公開(kāi)報(bào)道。公安部南京警犬研究所通過(guò)開(kāi)展犬人工授精和胚胎移植等項(xiàng)目的研究工作，熟練掌握了人工授精和胚胎移植等關(guān)鍵技術(shù)，在犬的現(xiàn)代繁殖生物技術(shù)方法方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。 《性別控制技術(shù)在警犬培育中的應(yīng)用》項(xiàng)目研究團(tuán)隊(duì)，經(jīng)過(guò)近三年的實(shí)驗(yàn)研究，目前取得了系列進(jìn)展：已經(jīng)成功分離出工作犬的X/Y精子，其平均純度在85%以上，分離后的X/Y冷凍性控精液也成功受孕，Y精液受孕母犬產(chǎn)仔3窩（16公，4母），X精液受孕母犬產(chǎn)仔1窩（5母，1公）。但在研究過(guò)程中，我們也發(fā)現(xiàn)工作犬的X/Y精子流式分選對(duì)受試種公犬的精子質(zhì)量要求很高，品種和個(gè)體差異性都較大，技術(shù)參數(shù)不穩(wěn)定。且相對(duì)牛、鹿等哺乳動(dòng)物，精子分選的速率不高，流式分選的經(jīng)濟(jì)成本也較高，想要實(shí)現(xiàn)由實(shí)驗(yàn)室到實(shí)際繁育生產(chǎn)中的大規(guī)模的推廣應(yīng)用任重道遠(yuǎn)。

相信隨著相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步和儀器設(shè)備的改進(jìn),流式細(xì)胞儀等分離精子的方法會(huì)越來(lái)越完善, 經(jīng)濟(jì)成本也會(huì)越來(lái)越低，犬精子流式分選性別控制技術(shù)在工作犬繁育生產(chǎn)中的應(yīng)用前景也越來(lái)越廣泛，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。