植物液泡膜H+-Pyrophosphatase基因功能研究進(jìn)展

劉 雪，張少英，王曉嬌

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010019)

液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶(H+-pyrophosphatase，H+-PPase，EC3．6．1．1)是一種區(qū)別于 H+-ATPase(EC 3．6．1．3)的質(zhì)子泵［1］，是一類將質(zhì)子轉(zhuǎn)運與焦磷酸水解相耦聯(lián)的焦磷酸酶．細(xì)胞的新陳代謝過程可產(chǎn)生大量的焦磷(diphosphate，PPi)，細(xì)胞質(zhì)中無焦磷酸酶(PPase)，而在液泡膜上存在一種以PPi為水解底物的H+-PPase．H+-PPase利用PPi水解產(chǎn)生的能量，將H+由胞質(zhì)泵入液泡中，與H+-ATPase共同執(zhí)行質(zhì)子泵的功能，如建立了跨液泡膜質(zhì)子驅(qū)動力，催化各種礦質(zhì)營養(yǎng)的主動運輸［2］，同時減少了PPi對細(xì)胞中生物大分子合成的影響．目前，已從多種植物中克隆獲到液泡膜H+-PPase的cDNA，對其生理生化性質(zhì)和功能也有了更深入了解．根據(jù)相關(guān)的研究方法，作者已經(jīng)初步得到了AVP1超表達(dá)甜菜植株，并初步驗證了轉(zhuǎn)基因甜菜的抗旱性優(yōu)于野生型．

本文主要介紹植物H+-PPase編碼基因的家族及其相關(guān)功能，并對部分同源基因在不同植物上遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在植物細(xì)胞中超表達(dá)對干旱、鹽等逆境脅迫的適應(yīng)進(jìn)行闡述．

1 液泡膜H+-PPase

1．1 液泡膜H+-PPase基因基本結(jié)構(gòu)特征

液泡膜H+-PPase是一類與膜結(jié)合的不可溶酶類，廣泛存在于植物中，少數(shù)存在于藻類、原生動物以及細(xì)菌中［3］．1992 年，Sarafian 等［4］首次從擬南芥中篩選克隆出完整液泡膜H+-PPase基因AVP1(Arabidopsis vacuolar H+-pyrophosphatase，M81892)．此后，相繼從多種陸生植物中克隆出液泡膜H+-PPase完整的cDNA，如煙草、大麥、甜菜、南瓜、水稻、綠豆、野大麥、小麥、披堿草、鹽地堿蓬、玉米［5］、陸地棉［6］、鹽爪爪、鹽芥、鹽藻、百脈根［7］、截形苜蓿［8］、藍(lán)桉［9］、小擬南芥［10］、梭梭［11］、費爾干豬毛菜［12］等(表 1)．研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)陸生植物液泡膜H+-PPase基因cDNA含有2 283～2 319個核苷酸，約編碼761～773個氨基酸殘基，蛋白結(jié)構(gòu)相似，以二聚體存在［13］．

表1 已克隆的植物液泡膜H+-PPase cDNA文庫Table 1 H+-PPase cDNA cloned from plants

對不同陸生植物擬南芥、煙草，大麥、甜菜、綠豆、水稻等具有的11個液泡膜H+-PPase氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)序列高度同源性，達(dá)到86% ～96%［15］．與之相比，陸生植物和藻類液泡膜H+-PPase氨基酸序列同源性較低．有些陸生植物中液泡膜H+-PPase具有多個同功酶，并在一些植物中克隆了編碼液泡膜H+-PPase同源基因，如煙草中已經(jīng)克隆出3個家族基因，水稻中有6個，大麥2個，甜菜中至少有2個［16］．這些同源基因的開放閱讀框架(ORF)高度保守，但非轉(zhuǎn)錄區(qū)的保守性很低［3］．H+-PPase是一個多基因家族．

1．2 液泡膜H+-PPase的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

Maeshima［3］在2000 年提出了液泡膜 H+-PPase的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型．在模型的一級結(jié)構(gòu)中，液泡膜H+-PPase包括13個loops(a-m)(其中6個液泡環(huán)、7個胞質(zhì)環(huán))，14個跨膜區(qū)域，同時具有3個高度保守區(qū)(CS1、CS2、CS3)．CS1位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)親水的 e環(huán)上，還存在與底物結(jié)合的部位(圖1)．對擬南芥、綠豆、輪藻、傘藻、光合細(xì)菌等5種生物的CS1、CS2、CS3序列比對發(fā)現(xiàn)，在CS1片段內(nèi)有一段氨基酸序列，即DVGADLVGKVE(253～263)(圖2下劃線)，具有高度保守特點．植物液泡膜H+-PPase序列中都含有CS1保守序列，因此，有學(xué)者猜想該位點可能是酶的催化位點［4］．綠豆CS1序列的帶電氨基酸殘基 Asp-253、Glu-263和 Lys-261對液泡膜 H+-PPase活性的穩(wěn)定性起到重要作用．同時發(fā)現(xiàn)CS2位于親水的i環(huán)上，在擬南芥AVP1上，該序列的Glu-427被Gln替換后，導(dǎo)致依賴PPi的H+轉(zhuǎn)運能力明顯降低，說明CS2在質(zhì)子轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用．位于C末端的CS3包含12個帶電氨基酸殘基．分析綠豆液泡膜H+-PPase的CS3保守區(qū)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域中含有3個Glu殘基，任何一個殘基被替換都導(dǎo)致酶活性的喪失．在煙草、甜菜、大麥、水稻、南瓜中的氨基酸序列也同樣具有保守性(圖2)．而液泡環(huán)和N 端不具有保守性［17］．

圖1 液泡膜H+-PPase的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模式［3］Figure 1 Topologicalmodel of H+-PPase from mung bean［3］

圖2 2種植物和3種其他生物液泡膜H+-PPase的高度保守序列對比［3］Figure 2 Alignment of H+-PPase segments containing the highly conserved motif from two plants and three other organisms［3］

在液泡膜H+-PPase中，還包含H+-ATPase家族具有的保守結(jié)構(gòu)域，例如在CS1中出現(xiàn)的DDPR和VGDN序列以及在CS3中出現(xiàn)的GDTIGD序列，表明CS3與CS1、CS2共同在H+-PPase酶的催化功能中起重要作用．保守結(jié)構(gòu)域 DDPR、VGDN和GDTIGD可能共同構(gòu)成V-PPase的催化核心區(qū)域［3］．

1．3 液泡膜H+-PPase的生化性質(zhì)

研究［18］發(fā)現(xiàn)，Mg2+對液泡膜 H+-PPase不僅具有激活作用，還能保護(hù)其免受熱失活，是一個必要的輔助因子．Rea等［19］提出在植物細(xì)胞質(zhì)中，Mg2+的濃度可能是控制H+-PPase活性的一個重要因素，Ca2+調(diào)節(jié)此酶的活性．在有些植物中，此酶的活性不同程度地受到 K+影響［20］．Drozdowicz等［21］發(fā)現(xiàn)了一種不同于 AVP1的液泡膜 H+-PPase，并命名為AVP2，同樣受到Mg2+的激活作用，但對K+不敏感，對Ca2+比較敏感，同時序列分析顯示AVP1和AVP2的同源性很低，僅有36%．因此，學(xué)者依據(jù)系統(tǒng)分類，將植物體中存在的H+-PPase分為2種類型，分別是Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型是以AVP1為代表的K+激活型，對Ca2+的抑制敏感度低，主要定位在液泡膜上，而Ⅱ型是以AVP2為代表的 K+遲鈍型，對Ca2+的抑制敏感度高，定位在高爾基體膜上［22］，初步證實了液泡膜H+-PPase活性受到K+和Ca2+的影響．另外在有些植物中，還有其他離子對H+-PPase的活性有一定的作用．

Zhen等［23］提出氨基亞甲基二膦酸鹽(Aminomethylene-bisphosphonate)是一種H+-PPase活性抑制劑，并且對綠豆的H+-PPase抑制常數(shù)很明顯，約為1．8μmol/L．這種抑制劑不僅作用于所有的植物H+-PPase和光合細(xì)菌的PPi合酶，還作用于鼠類肝臟細(xì)胞和酵母菌中的V-ATP酶、細(xì)胞質(zhì)可溶性焦磷酸酶等．Gordon-Weeks等［24］提出在雙膦酸鹽碳鏈上的氮原子可以提高V-ATPase的抑制效果．

2 液泡膜H+-PPase的功能

2．1 質(zhì)子泵功能

在植物生長過程中，大分子物質(zhì)如RNA、蛋白質(zhì)、糖類、脂類等的生物合成過程都會產(chǎn)生大量的PPi，高濃度PPi會抑制植物的正常代謝，影響植物的生長發(fā)育．液泡膜H+-ATPase和H+-PPase均能夠水解PPi，產(chǎn)生的能量催化H+從胞質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運到液泡中．同時泵入液泡的大量H+形成跨膜電化學(xué)梯度，一方面，為各種溶質(zhì)分子跨液泡膜主動運輸提供驅(qū)動力［2］，維持細(xì)胞離子平衡和滲透平衡，調(diào)節(jié)植物體的pH值，減少對植物的傷害;另一方面，可使液泡酸化和細(xì)胞質(zhì)堿化，有利于細(xì)胞中各種生理生化反應(yīng)的進(jìn)行［14］．

2．2 影響植物生長發(fā)育

Li等［25］發(fā)現(xiàn)擬南芥超表達(dá)AVP1使植物器官形成初期的細(xì)胞分裂加快、增生加快、根系發(fā)達(dá)、生長素轉(zhuǎn)運蛋白數(shù)目增加;而avp1缺失突變體子葉畸形，其地上部和根發(fā)育均受到抑制，大多數(shù)植株的花芽分化和生殖器官的形成受到影響，導(dǎo)致不能有性結(jié)實，生長素分布發(fā)生變化，生長素運輸效率降低．Feriani等［26］分離到一個子葉生長有缺陷的擬南芥突變體fugu5，與突變體 avp1相似，對液泡膜H+-PPase與植物生長素調(diào)節(jié)器官之間的關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)avp1突變體生長受到抑制是對高濃度生長激素的應(yīng)答反應(yīng)，證明植物液泡膜H+-PPase對植物生長激素沒有控制運輸?shù)淖饔茫号菽+-PPase和生長激素的運輸?shù)年P(guān)系還有待進(jìn)一步研究．

在缺乏AVP1基因的擬南芥植株體內(nèi)中積累了大量的PPi，導(dǎo)致植株糖異生過程無法正常進(jìn)行，在種子萌發(fā)后不能正常生長［27］．將AVP1超表達(dá)煙草，植株的葉片大小以及質(zhì)量明顯提高，說明植物中液泡膜H+-PPase對植物生長發(fā)育有重要作用．

2．3 增強植物抗逆性

為了減輕鹽分過高對植物造成生理干旱，植物細(xì)胞主要依靠離子區(qū)域化的方法，通過液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+和Cl-區(qū)隔在液泡中，以此來減輕其對細(xì)胞質(zhì)的毒害作用［28］．在離子區(qū)域化過程中，液泡膜質(zhì)子泵(H+-ATPase和H+-PPase)為液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白提供區(qū)隔Na+和Cl-的驅(qū)動力．由此認(rèn)為提高液泡膜質(zhì)子泵基因的表達(dá)，可以增大H+的跨膜梯度，為Na+/H+交換提供更大的驅(qū)動力，使過多的Na+區(qū)域化，從而使植物細(xì)胞的耐鹽性和抗旱性增強．與液泡膜H+-ATPase相比，液泡膜H+-PPase的結(jié)構(gòu)簡單，只是一條由單一基因編碼的多肽鏈組成，更容易實現(xiàn)超表達(dá)［29］．

Gaxiola等［29］用擬南芥液泡膜 H+-PPase基因AVP1過量表達(dá)編碼液泡膜H+-PPase蛋白，提高轉(zhuǎn)基因植物對鹽堿及干旱的耐受性．為了驗證此基因在不同物種中的作用．Gao等［30］發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)AVP1同源基因，可以提高轉(zhuǎn)基因植物根的發(fā)育，并增強植物耐鹽性．Lv等［31］研究棉花中AVP1同源基因表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花根的發(fā)育以及對鹽的耐受力均有提高;該基因的表達(dá)可以提高棉花對干旱的耐受力．胡有貞等［32］通過農(nóng)桿菌浸染花序的方法將灰綠藜液泡膜H+-PPase基因(CgVP1)導(dǎo)入擬南芥，能顯著提高其耐鹽能力．在2011年，Pasapula等［33］再次證實了在 200 mmol/L NaCl水培或土培條件下，轉(zhuǎn)AVP1基因棉花比野生型植株對干旱和鹽脅迫具有更強的耐受性．2012年Yao等從鹽生植物鹽爪爪中得到的KfVP1，2013年Gamboa等［9］從藍(lán)桉中分離出的EVP1等，實驗結(jié)果都表明了液泡膜H+-PPase在植物響應(yīng)逆境脅迫(干旱和鹽脅迫)中起到重要作用．

2．4 參與蔗糖的生物合成

Lerchl等［34］發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的蔗糖合成酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶共同作用，將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和己糖磷酸鹽．植物液泡膜H+-PPase清除此過程中產(chǎn)生的大量PPi．在缺乏磷素的條件下，轉(zhuǎn)H+-PPase基因玉米的根系比野生型植株更發(fā)達(dá)［35］．

3 液泡膜H+-PPase基因的遺傳轉(zhuǎn)化

有關(guān)H+-PPase基因在植物中的遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究才十幾年的時間，但取得了很大的進(jìn)展．目前研究主要集中在擬南芥AVP1的遺傳轉(zhuǎn)化方面．

Gaxiola等［29］在2001年首次將 AVP1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在250 mmol/L NaCl的條件下，超表達(dá)AVP1植株能正常生長，葉面積和鮮質(zhì)量顯著增加，其抗鹽性增強，同時轉(zhuǎn)基因植株幼苗中AVP1蛋白水平顯著高于野生型．此后，該家族基因常被用于植物耐鹽抗旱能力的改造．2005年，Park等［36］將AVP1基因轉(zhuǎn)入番茄中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的根系生長較快且發(fā)達(dá)，生物量增加顯著，其抗旱性也增強．2006年，Zhao等［37］將鹽地堿蓬中的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHX1和擬南芥中的AVP1基因同時轉(zhuǎn)入水稻中，共同超表達(dá)對水稻耐鹽性效果好于單基因超表達(dá)．Brini等［38］發(fā)現(xiàn)小麥H+-PPase基因TVP1在擬南芥中超表達(dá)可以增強其耐鹽性和抗旱性．同時，Yang等［39］的研究結(jié)果表明，AVP1基因在水稻、擬南芥、煙草中的超表達(dá)都促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株根系吸收K+和釋放有機酸，使其在低磷條件下可以吸收更多的磷，促使其更好的生長．在2008年，Lv和Li等分別證明了鹽芥H+-PPase基因 TsVP1 在棉花［31］和玉米［40］中超表達(dá)后提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性．

將 AVP1 基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿［41］、百脈根［42］、甜菜［43］、多花黑麥草［44］、匍匐翦股穎［45］等，實現(xiàn)超表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株具有較強的抗旱性和耐鹽性．Xu等［10］將小擬南芥H+-PPase基因OpVP轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因植株同樣表現(xiàn)出較高的耐鹽性．該家族基因不僅可以改善受體植物的抗旱、耐鹽性，還改變了其形態(tài)結(jié)構(gòu)，根系生長能力增強、葉面積增大、籽粒產(chǎn)量增加和棉花纖維產(chǎn)量提高等．本課題組已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)AVP1基因的甜菜株系，在甜菜中過量表達(dá)對甜菜磷素吸收和提高抗旱耐鹽性具有積極作用．相關(guān)機能正在探討中．

除了植物中的H+-PPase基因能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性，D'yakova等［46］報道了光合細(xì)菌H+-PPase基因在煙草中超表達(dá)也可以提高其耐鹽性．

研究表明液泡膜H+-PPase在植物的耐鹽抗旱性中起重要作用．液泡膜H+-PPase基因的超表達(dá)可以明顯提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽抗旱性，將H+-PPase基因轉(zhuǎn)入植物中，可以獲得耐鹽性和抗旱性較強的轉(zhuǎn)基因植物新品種，該基因的廣泛利用為增強植物抗性、提高作物產(chǎn)量提供新的思路和途徑，具有應(yīng)用前景．

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