海洋貝類細胞培養(yǎng)技術及其應用

李建軍，黃寶玉

（1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041；2.中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071；3.中國科學院大學，北京 100049）

細胞培養(yǎng)技術是指在體外模擬體內(nèi)細胞生長環(huán)境，置細胞于無菌，充足的營養(yǎng)條件，以及適宜的溫度和酸堿度條件下，細胞能正常生長繁殖，并能維持結構和功能的一種技術。自從Harrison 于1907年以淋巴液做培養(yǎng)基進行蛙胚神經(jīng)組織細胞的培養(yǎng)實驗取得成功后，細胞培養(yǎng)技術經(jīng)過一個多世紀的發(fā)展已日臻成熟，并成為生物、醫(yī)學研究及應用廣泛采用的技術方法。利用細胞培養(yǎng)的基礎開展體外試驗，已成為闡釋生命機理，解釋某些疾病的發(fā)病機制以及篩選藥物的重要手段（薛慶善，2001）；另外，利用細胞培養(yǎng)與細胞融合（Cell fusion），轉基因（Transgene） 技術相結合的手段可以進行基因重組、組織構建等。在產(chǎn)業(yè)上，利用細胞培養(yǎng)可以批量生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等，大大提高了效率并降低了成本（王捷，2004）。

目前，全世界已建立的細胞系至少有數(shù)千種，其中包括人和動物的正常細胞、腫瘤細胞以及遺傳缺陷型細胞等。這也為低等動物細胞培養(yǎng)的研究提供了大量指導和參考。Grace等（1962） 實現(xiàn)了鱗翅目昆蟲天蠶蛾（Antheraea eucalypti） 卵巢細胞系的建立（Grace，1962），開創(chuàng)了無脊椎動物病毒學、環(huán)境毒理學、遺傳學和基因組學等研究領域（張博等，2011；艾慶輝等，2012）。然而，水生的無脊椎動物的細胞培養(yǎng)卻面臨重重困難。到目前為止，也僅建立了一種淡水蝸牛擔輪幼蟲胚胎（Biomphalaria glabrata embryonic，BGE） 細 胞 系（Hansen，1976）。迄今為止，在海洋無脊椎動物中尚未建立起成功的細胞系，目前的細胞培養(yǎng)多停留在原代培養(yǎng)和有限傳代培養(yǎng)的水平。因此，建立海洋無脊椎動物的細胞系是當前國際上的攻關課題（郎剛華等，2000a）。鑒于最近我國近海污染比較嚴重，海洋貝類的重金屬富集現(xiàn)象突出，海洋貝類食品安全問題日益明顯。而海洋貝類細胞培養(yǎng)能為相關研究提供迅速靈敏的檢測工具，應用前景廣闊。此外，隨著以長牡蠣全基因組序列的測序完成（Zhang et al，2012），以牡蠣為代表的海洋貝類功能基因的驗證工作必將掀起前所未有的高潮。而相應的細胞系的建立能為基因功能驗證提供強有力工具。現(xiàn)就貝類細胞的培養(yǎng)的意義及現(xiàn)狀做一簡要綜述。

1 貝類細胞培養(yǎng)的研究意義

1.1 進行貝類基因功能驗證

無論是高等的哺乳動物還是較為低等的水生無脊椎動物，基因功能的深入驗證離不開相應細胞系的建立。無論是轉染基因過表達蛋白還是基因的敲低，敲除，沒有細胞系的成功建立，這些功能基因驗證的常規(guī)實驗都很難開展。細胞系的建立對功能基因驗證的重要性在此也不再贅述。

1.2 在貝類免疫以及病害防治研究中的應用

貝類作為軟體動物缺少獲得性免疫，只能依靠自身的天然免疫系統(tǒng)來抵御外來的病菌等。近年來，經(jīng)濟貝類如牡蠣病毒病害相當嚴重，嚴重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)的發(fā)展（Martenot et al，2010）。體外培養(yǎng)的細胞具有使病毒復制的全部條件，因此體外培養(yǎng)的細胞可以用于增殖甚至分離鑒定病毒，為貝類病毒學的理論研究以及后續(xù)抗病毒藥物的開發(fā)提供理論指導。利用原代培養(yǎng)的血細胞與病原菌體外共培養(yǎng)的方法已經(jīng)廣泛應用于貝類免疫分子機制的研究（Qiu et al，2007；Yu et al，2012）。此外，多種螺類是人類寄生蟲的中間宿主，相關的研究能為提高貝類食品安全提供保障，而體外細胞培養(yǎng)可為研究這些寄生蟲與宿主的互作提供簡便快捷的實驗工具。

1.3 貝類珍珠形成機理研究

貝類珍珠的形成機制一直為人們所關注。目前對于分泌珍珠質的細胞生物學機制還了解不多，而基于個體或組織水平上的分析又有諸多不便，所以對于外套膜上皮細胞培養(yǎng)的研究對于珍珠產(chǎn)生機制的揭示具有重大意義?，F(xiàn)代人工珍珠培養(yǎng)技術就是將供體珍珠貝外套膜組織塊單獨或與珠核一并植入受體珍珠貝體內(nèi)形成無核珍珠或有核珍珠（王愛民等，2003）。那么能否模擬珍珠貝體內(nèi)的環(huán)境，體外培養(yǎng)外套膜組織使之形成珍珠囊，最終在培養(yǎng)瓶中培育“試管珍珠”呢？這是長久以來人們的美好愿望，而愿望的實現(xiàn)首先要解決的問題就是珍珠貝體外細胞的培養(yǎng)。

1.4 應用于環(huán)境檢測

海洋雙殼貝類具有廣泛的地域分布，也較易采集。固著、慮食的生活習性決定了貝類較容易在體內(nèi)富集污染物，如牡蠣體內(nèi)就能富集大量的重金屬。因此貝類可作為凈化水質和檢測水污染的優(yōu)選生物（Latire et al，2012）。由于貝類大部分是人們喜愛的肉質鮮美的食品，因此這也是關乎人類食品安全的大問題。如能建立起成功的貝類細胞系，那么這種分散的細胞相比動物個體來說具有操作簡單、檢測迅速準確以及靈敏度高等不可比擬的優(yōu)點。因此細胞培養(yǎng)在環(huán)境檢測方面以及相應的貝類食品安全等級評估等也顯示出廣泛的應用價值。

1.5 神經(jīng)生物學的研究以及貝類腫瘤的研究等

神經(jīng)生物學是21 世紀的明星學科。神經(jīng)系統(tǒng)是異常復雜與精密的，所以其研究難度可想而知。軟體動物擁有巨大的神經(jīng)元，是研究神經(jīng)生物學的難得的實驗材料。并且由于其神經(jīng)系統(tǒng)結構相對簡單，比較容易鑒定和適于機械和一些電生理操作，所以神經(jīng)細胞的培養(yǎng)已廣泛用于神經(jīng)軸突生長和再生的研究（Rinkevich，1999；Tamse，1995） 等。另外，貝類的細胞培養(yǎng)對于貝類腫瘤的研究等也具有重要意義。

2 貝類的細胞培養(yǎng)研究現(xiàn)狀及應用

在無脊椎動物細胞培養(yǎng)的研究方面，海洋貝類的細胞培養(yǎng)在過去的半個世紀里研究最為廣泛。雖然截至目前還沒能培育出一個能無限傳代成功的細胞系，但是海洋貝類的原代細胞的培養(yǎng)依然應用到了各個方面的研究。由于開展的研究較多，以下就海洋貝類不同組織的細胞培養(yǎng)做一簡述。

2.1 血淋巴細胞培養(yǎng)

海洋無脊椎動物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，血液是重要的免疫器官。細胞培養(yǎng)作為良好的體外實驗模型非常適用于血細胞對外毒物的反應的研究。Qiu等（2007） 利用原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝Chlamys farreri 血細胞探究了血細胞在細菌脂多糖LPS 刺激下免疫相關基因CfToll-1 表達量的變化情況。劉靜等利用培養(yǎng)的櫛孔扇貝血細胞篩選了細胞活性檢測的方法，并且研究了苯并芘對櫛孔扇貝血細胞的影響（劉靜 等，2009）。Yu 等（2012） 利用多種病原相關分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs） 刺激培養(yǎng)的長牡蠣Crassostrea gigas 原代血細胞來研究相關基因表達隨時間的變化情況。

2.2 鰓組織細胞培養(yǎng)

在國外，鰓組織細胞的培養(yǎng)在貽貝中研究的較多。國內(nèi)的鰓細胞的研究在皺紋盤鮑，中國蛤蜊，菲律賓蛤仔，牡蠣中均有開展。李霞等（1997） 對皺紋盤鮑Haliotis.discus hanai 鰓組織細胞體外培養(yǎng)做了研究，用E-MEM 培養(yǎng)液成功將鰓細胞傳代培養(yǎng)了10 代和11 代。崔龍波等（2000） 進行了皺紋盤鮑鰓細胞培養(yǎng)條件的摸索，并成功把其中兩株鰓細胞分別傳代培養(yǎng)了22 代和30 代。孫振興等（2005） 將中國蛤蜊Mactra.chinensis 的鰓組織在RPMI1640 培養(yǎng)基中進行了原代培養(yǎng)。實驗結果表明，在溫度26 ℃～27 ℃，pH=7.4，培養(yǎng)基中不添加小牛血清的條件下，中國蛤蜊的組織也能正常生長。鰓組織培養(yǎng)24 小時后即有游離細胞從組織塊遷出，最長培養(yǎng)時間可持續(xù)至第12 天。孫振興等（2004） 還以菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 的鰓組織為材料，分別用E-MEM 和M199 培養(yǎng)基對鰓細胞進行了原代培養(yǎng)。結果表明，兩種培養(yǎng)基均滿足菲律賓蛤仔鰓組織細胞培養(yǎng)的要求，細胞均能正常遷出和增殖（孫振興 等，2004）。鄧瑞鵬等（2004） 利用RPMI1640 培養(yǎng)基對僧帽牡蠣Saccostrea cucullata 的鰓組織進行了培養(yǎng)。并在此基礎上研究了毒性較大的氯化三丁基錫對牡蠣鰓組織細胞的細胞形態(tài)以及存活率的影響。王彬等（2010）采用改良的DMEM 培養(yǎng)基成功的培養(yǎng)了近江牡蠣鰓組織的原代細胞。

2.3 外套膜細胞培養(yǎng)

王愛民等（1995） 經(jīng)反復試驗，篩選出適宜于馬氏珠母貝Pinctada martensii 外套組織培養(yǎng)的平衡鹽溶液（改進的MMBSS）、基本培養(yǎng)基，并且確立了防止污染的組織凈化方法，并篩選出一種能促進細胞貼壁的物質。并在此基礎上，用偏光顯微鏡、掃描電鏡及X-射線能譜分析儀對所培養(yǎng)細胞的分泌物進行觀察，為進一步探索體外珍珠提供了證據(jù)（王愛民等，2003）。

李霞等（1997） 用E-MEM 培養(yǎng)基成功將鮑外套膜細胞傳至19 代。郎剛華等選用多種合成培養(yǎng)基與無機鹽、小牛血清配合進行櫛孔扇貝外套膜細胞的培養(yǎng)。通過反復實驗發(fā)現(xiàn)以199 培養(yǎng)基為培養(yǎng)基的主要成分，添加各種鹽以調(diào)整其滲透壓和pH值，另外再加入20%小牛血清等成分為最佳（郎剛華等，2000b）。陳頡等（2007） 則采用改良的M199 培養(yǎng)基，研究文蛤Meretrix meretrix 外套膜細胞在不同溫度和鹽濃度條件下細胞的生長情況，他們培養(yǎng)的細胞可持續(xù)30～35 d。Gong 等（2008） 成功對對合浦珠母貝Pinctada fucata 的外套膜細胞進行了原代培養(yǎng)。并初步研究了其外表皮細胞參與生物礦化的殼基質蛋白分泌過程。他們的原代細胞培養(yǎng)基選用的是L-15 與M199 按1 ∶1 混合的培養(yǎng)基。并且添加了抗壞血酸，?；撬幔榘椎鞍姿馕锛案黝惪股?。在培養(yǎng)24 h 后細胞從組織塊中遷出，流式細胞儀檢測表明遷出的細胞處于G0/G1期的占83.8%，S 期的占14.61%，G2/M 期的僅1.59%，表明細胞蛋白合成非常活躍，但是幾乎無增殖。

2.4 其他組織細胞的培養(yǎng)

除以上組織的原代細胞培養(yǎng)外，另外組織細胞的原代培養(yǎng)也有很多嘗試。如心肌組織細胞，消化腺細胞，足肌細胞等。如Renault 等（1995） 對歐洲牡蠣Ostrea.edulis 心肌組織的細胞培養(yǎng)。他們從基本培養(yǎng)基、添加物、促貼壁物質等方面都進行了優(yōu)化。結論是：心肌細胞最佳的培養(yǎng)條件為無菌海水（含3%L-15 培養(yǎng)基） 與長牡蠣C.gigas 血淋巴按1 ∶1 混合，同時添加10% Fetal Bovine Serum（FBS），促貼壁物質多聚賴氨酸等。You 等（2012） 則利用L-15 培養(yǎng)基添加酵母提取物的方法成功培養(yǎng)文蛤消化腺細胞，并在此基礎上，成功開展RNA 干擾實驗。足肌細胞的培養(yǎng)在皺紋盤鮑中有過嘗試，但未能進行傳代。Takeuchi 等（1998） 對地中海貽貝Mytilus galloprovincialis 的足細胞培養(yǎng)進行的比較成功，基礎培養(yǎng)基L-15 中添加20%FBS 進行培養(yǎng)。經(jīng)膠原酶處理獲得的單細胞，4～7 d 便能形成單層，并且可進行傳代；經(jīng)胰酶消化后移至新培養(yǎng)瓶中的細胞可貼壁并增殖，7 d 內(nèi)形成單層，研究還發(fā)現(xiàn)原代及傳代細胞中的足絲蛋白Mgfp-1、Mgfp-2、Mgfp-3 基因可以穩(wěn)定的進行轉錄。

還有其他關于海洋貝類原代細胞培養(yǎng)的嘗試，在此就不一一列舉。

3 貝類細胞培養(yǎng)面臨的主要困難

3.1 培養(yǎng)基及促生長添加因子

對于貝類細胞的培養(yǎng)，基礎培養(yǎng)基的選擇應該不是難題，由以上的敘述可以看出，無論是EMEM，M199，還是L-15 或是M199 與L-15 培養(yǎng)基的混合液，細胞生長基礎的營養(yǎng)應該都能供給。關鍵是在促生長的添加因子方面，一直沒能尋得一種或是幾種混合的生長因子來促進貝類細胞的生長繁殖。大量的已有研究成果表明，不能單純的套用哺乳動物細胞培養(yǎng)模式，必須要充分的認識海洋貝類動物與哺乳動物的不同，深入研究貝類細胞的營養(yǎng)代謝以及細胞生理等，以便研發(fā)海洋貝類細胞培養(yǎng)所適用的培養(yǎng)基。像培養(yǎng)細胞小牛血清的利用，永生型BGE 細胞系的成功建立也表明，貝類細胞培養(yǎng)對小牛血清的依賴是不明確的，更有可能小牛血清中一些不確定的營養(yǎng)成分對貝類細胞的生長是有害的。對于不同的貝類，甚至是同種貝類不同組織的細胞，可能對營養(yǎng)以及生長因子的需求是不同的。這些都是需要明確并且亟待解決的問題。

3.2 污染防治問題

污染防治的問題一直是細胞培養(yǎng)面臨的大問題。微生物污染是細胞培養(yǎng)過程中的大敵，其中以細菌、真菌和支原體污染最為常見。海洋貝類開放的生活環(huán)境，決定了其本身的器官組織有攜帶大量病菌的可能。雖然在自然條件下，貝類通過自身復雜精密的免疫調(diào)節(jié)嫻熟的應對來自海洋的形形色色的侵擾，但是培養(yǎng)的細胞卻失去了這種功能。通過怎樣的手段或試劑來對組織進行徹底消毒，而又不影響海洋貝類細胞本身的活力成為困擾眾多研究者的難題之一，有很大一部分的貝類細胞的培養(yǎng)終因污染而告終。另外，除以上細胞培養(yǎng)常見的污染之外，貝類細胞的培養(yǎng)還可能會受單細胞真核生物的污染，如阿米巴蟲等（鐘秀穎，2009），更增加了貝類細胞培養(yǎng)污染防治的難度。

3.3 細胞永生性轉化問題

要建立一個成功的貝類細胞系，永生性是一個必須面對的問題。目前對于海洋無脊椎動物特別是貝類細胞增殖調(diào)控的知識知之甚少，分析其細胞周期和了解細胞分裂的分子機制將為永生性細胞的培養(yǎng)提供理論依據(jù)。近年來為了獲得永生性的細胞系，轉永生性相關基因技術、物理和化學誘變技術以及細胞雜交技術已有了初步的發(fā)展和應用，這也為解決海洋貝類細胞培養(yǎng)的永生性轉化問題帶來了新的希望。因此，尋找和深入挖掘海洋貝類的永生性轉化相關基因，探究物理和化學方法誘變海洋貝類細胞的方法和條件，或是與其他永生性細胞雜交都是今后需要進一步開展的工作內(nèi)容。

海洋貝類重要的經(jīng)濟和科研地位讓越來越多的人為其細胞系的建立不斷探索，多年來學者們對貝類細胞系的追求一直沒有停止，也取得了相當多的成就，積累了豐富的經(jīng)驗資料等。但是由于各種問題的限制，海洋貝類細胞的培養(yǎng)現(xiàn)在仍然停留在原代細胞培養(yǎng)條件的摸索或如何使細胞在體外生存較長時間的階段。如何在體外使貝類細胞無限增殖仍然是全世界所面臨的難題?？傊?，要實現(xiàn)海洋貝類細胞建系的目標，首先要得到適合海洋貝類生長的合適的培養(yǎng)基，其次添加合適的生長因子等使細胞成功的進行傳代，再次通過一系列的手段實現(xiàn)細胞的永生性轉化，最終獲得細胞系。海洋貝類細胞系的成功建立也必將為相關的分子生化研究以及提升海洋貝類食品安全等級提供保障。

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