副豬嗜血桿菌研究進展

方 勤,傅勝才

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙410131）

副豬嗜血桿菌是一種能引起漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎及腦膜炎的兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，該病癥是由Glasser于1910年進行了描述，所以稱該病為Glasser病，但該菌直到1922年才由Schermer和Ehrlich分離出來，它與豬嗜血桿菌極為相似，在生長時都需要V因子（NAD），但Biberstein和White在1969年的研究表明其不需要X因子，所以按照國際命名慣例，使用“para-”前綴將其命名為“副豬嗜血桿菌”（Haemophilusparasuis，HPS)。HPS的研究已有百年的歷史，其血清型目前已達15種，尚有一些不能分型，而且比例正在逐年增加，為了加強對其研究，新的方法已經(jīng)變得越來越迫切。經(jīng)過科學(xué)前輩們的研究，基因分型已經(jīng)變得更加普遍和實用，但其基因型眾多遠遠超過血清型，而且沒有統(tǒng)一的圖譜，也證明這項技術(shù)尚未成熟。HPS較難分離，因為其需要較高的營養(yǎng)環(huán)境以及在外界環(huán)境下極易死亡（通常需在12小時以內(nèi)進行病原分離），另一方面抗生素的使用，其分離率變得更低。HPS的培養(yǎng)基主要有TSA（固）、TSB（液）、巧克力瓊脂培養(yǎng)基（固），而且需要加入一定濃度的NAD才能正常生長。HPS的鑒定方法主要有生理特性鑒定、生化鑒定和PCR鑒定?？贵w水平檢測以間接-ELISA最為常見，而且包被的抗原有多種選擇，如莢膜多糖、OMP5、HPS全菌體等。HPS疫苗多種多樣，包括滅活苗、活疫苗、亞單位疫苗、菌影疫苗等，以制作方法、經(jīng)濟效益、安全程度等多方面考慮，通常首選滅活疫苗。在此，對HPS研究進展綜述如下。

1 病原學(xué)研究進展

1.1 病原形態(tài)與培養(yǎng)特性

HPS在加入NAD的巧克力平板上為光滑的灰白色小菌落，經(jīng)過革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌，培養(yǎng)20～28h，呈現(xiàn)短桿狀、球狀、球桿狀等多種形態(tài)，其中以短桿狀為主；培養(yǎng)72h后分離菌出現(xiàn)桿狀或者長絲狀，且以長絲狀較多。從健康豬上呼吸道分離到的HPS大多數(shù)有莢膜，而其他部位分離到的菌株多數(shù)無莢膜，通過活體傳代可以篩選有莢膜的HPS，但是在培養(yǎng)基上多次傳代有莢膜細菌的數(shù)量就會減少甚至沒有。HPS的外膜蛋白（OMP）共有8種[1]，而且與HPS的毒力有關(guān)[2～3]。在培養(yǎng)基的篩選方面陳勇等[4]的研究結(jié)果證明HPS在加入NAD的TSA、TSB和巧克力瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在LB、不含NAD的TSA、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、馬丁肉湯不生長，以NAD濃度大于0.08g/L的巧克力培養(yǎng)基上生長最好。

1.2 血清學(xué)研究

1952年Bakos描述4種HPS的血清型被命名為A-D血清型。隨后Morozumi和Nicolet于1986年將其血清型增加到7個，Kielstein于1991年又增加了另外 6個 Jena血清型，Kielstein和Rapp-Gabrielson于1992年再次驗證增加5個ND血清型?；谔囟ǖ耐每寡迕庖邤U散試驗(ID），Kielstein和Rapp-Gabrielson于1992年建議將HPS重新命名且分類。將1952年至1986年檢測到血清型命名為1～7型，Jena血清型和ND血清型在統(tǒng)一血清型之后被命名為8～15血清型，之后這個分類原則被世界廣泛接受，HPS被定義為15個血清型[5]，但是大約20%的分離株血清型不可定[6]。近年來，越來越多的臨床菌株已不能按照瓊脂擴散實驗進行血清學(xué)分型，而且不可分型菌株的比例上升到41%[7]。而且經(jīng)過臨床實驗王興美等[8]證實在血清型中以1、5、10、12、13、14型具有強毒力，可致死患豬；2、4、15型具有中等毒力，不能致死但影響生長；3、6、7、8、9、11型毒力最弱，臨床特征表現(xiàn)不明顯。

1.3 基因型研究

基因分型的方法很多，包括蛋白多態(tài)性圖譜分型法、限制性核酸內(nèi)切酶指紋圖譜分型法、PCR分型法。蛋白多態(tài)性圖譜分型法又包括多位點酶電泳圖譜分型法和外膜蛋白指紋圖譜分型法，PCR分型法包括Rep-PCR技術(shù)分型法和PCR-RFLP分型法[9]。

多位點酶電泳圖譜分型法是用通過用淀粉凝膠水平電泳分析多種酶的多態(tài)性獲得電泳圖譜，Blackall等[10]在1997用該方法研究40個澳大利亞HPS分離株和8個標準株（1、2、3、4、8、9型及2個5型）獲得A、B兩類一共33種電泳圖譜和一種單一條帶(代表一個不同的種或亞種)。外膜蛋白指紋圖譜分型法是用電泳的方法獲得蛋白質(zhì)圖譜，Ruiz等[2]在2001年研究了HPS的OMP的基因型與菌株分離部位之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)來自多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的病豬的28個HPS分離株形成了A、B兩類OMP電泳圖譜，其電泳條帶在相對分子質(zhì)量為3.63×104～3.85×104的區(qū)間上；來自健康豬呼吸道的18個HPS分離株形成了C、D、E、F和G等5類OMP電泳圖譜；來自肺炎病豬呼吸道的7個HPS分離株顯示出A、B、H和I型等4種OMP電泳圖譜。表明在相對分子質(zhì)量為3.63×104～3.85×104的電泳條帶的A、B兩類OMP指紋圖譜可能與HPS毒力有關(guān)。限制性核酸內(nèi)切酶指紋圖譜分型法是運用限制性核酸內(nèi)切酶指紋技術(shù)獲得指紋圖譜，Smart等[11]在1988年運用該技術(shù)研究了HPS在SPF豬和飼養(yǎng)豬的定居和分布，檢測了69個分離菌株，得到37個限制性核酸內(nèi)切酶指紋圖譜，其中24株有特異的限制性核酸內(nèi)切酶指紋圖譜，剩余45株形成13個有交叉的限制性核酸內(nèi)切酶指紋圖譜。Rep-PCR技術(shù)是一種以能與基因組重復(fù)序列互補的寡聚核苷酸為引物，擴增出與重復(fù)序列之間長度不等的DNA片段，再電泳分離其擴增產(chǎn)物，從而建立特定細菌的特異DNA指紋圖譜，又因為單個菌株的變異與重復(fù)序列之間的距離有關(guān)，以重復(fù)序列為探針的基因組指紋還可以鑒定不同細菌及其變異。PCR-RFLP分型法是由Dela等[12]在2000年對豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)血清7型和HPS血清3型的tbpA基因序列分析的基礎(chǔ)上，合成了1對特異引物，并用PCR技術(shù)擴增了15個HPS標準株的tbpA基因，再分別用限制性內(nèi)切酶RsaI、TaqI和AvaI進行處理，結(jié)果限制性內(nèi)切酶RsaI酶產(chǎn)生10種RFLP圖譜，限制性內(nèi)切酶TaqI產(chǎn)生5種RFLP圖譜，限制性內(nèi)切酶AvaI產(chǎn)生3種RFLP圖譜。其中血清5、12、14和15型限制性內(nèi)切酶圖譜是一樣的，綜合AvaI、RsaI和TaqI的RFLP圖譜，HPS的15種標準血清型形成12種標準RFLP型。

2 流行病學(xué)研究

HPS是豬的常駐菌，病原主要存在于上呼吸道，發(fā)病豬和隱性感染豬為本病的傳染源，主要通過豬群間的直接接觸和空氣污染進行傳播，營養(yǎng)不良、仔豬免疫缺乏、混群為其主要誘因，臨床癥狀是仔豬被毛粗亂、咳嗽、呼吸困難和生長遲滯，剖檢主要可見漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。在我國HPS以4型（24.2%）、5型（19.2%）和13型（12.5%）最為流行[13]。周斌等[14]在2008年從華東地區(qū)養(yǎng)豬廠送檢的病豬中分離到13株HPS，屬6個血清型，其中1型2株，4型4株，5型2株，12型2株，10型和13型各一株。陸國林等[15]在2010年從浙江省5個縣分離到26株HPS，其中4型8株，5型6株，12型5株，13型2株，其余5株無法分型。劉輝等[16]在2011年檢測HPS在陜西關(guān)中地區(qū)的感染狀況，從陜西關(guān)中地區(qū)14個發(fā)生關(guān)節(jié)炎和漿膜炎的豬廠采集30份病料，通過分離得到5株HPS，并參考Redondo等[17]建立的針對HPStbpA基因的PCR-RFLP分型方法，采用3種限制性內(nèi)切酶TaqI、AvaI、AfaI對5個分離菌進行了RFLP分析，得到4種圖譜，其中一株與Redondo報道的血清13型標準菌株相同。

3 致病機理研究

HPS的毒力因子與外膜蛋白相關(guān)，其致病方法主要有兩種途徑，一種途徑是HPS通過引起上呼吸道黏膜表面纖毛上皮損傷使得纖毛活動性降低以及鼻黏膜和支氣管黏膜急性腫脹導(dǎo)致黏膜損傷，從而增加致病細菌入侵機會，導(dǎo)致發(fā)病。另一種是由Lichtensteiger等[18]在研究HPS的唾液酸酶時發(fā)現(xiàn)這種酶能與透酶和醛縮酶發(fā)生協(xié)同作用，從而奪取宿主細胞的碳水化合物使得機體營養(yǎng)方面的問題而增強細菌毒力；除此之外，唾液酸酶還可以通過清除與宿主細胞糖原結(jié)合的唾液酸，從而暴露出一些致病細菌定居或侵入宿主細胞所需要的受體，以及降低黏蛋白的黏性來干擾宿主的防御系統(tǒng)。

4 疫苗研究

HPS疫苗多種多樣，包括滅活苗、活疫苗、亞單位疫苗、菌影疫苗等。滅活疫苗包括商品滅活苗和自家滅活苗。目前，市場上商業(yè)化的疫苗主要有3種：HPS滅活疫苗Z-1517株、HPS滅活疫苗SV-1株+SV-6株、HPS滅活疫苗4型MD0332株+5型SH0165株[19]?；钜呙缡怯梢环N能產(chǎn)生交叉免疫力的弱毒突變HPS菌株制得。2011年由Newport實驗室研制出第一株商業(yè)化的HPS活疫苗—Parasail疫苗。試驗結(jié)果證明，Parasail疫苗可對豬群提供異源血清型4、5和13型之間的交叉保護。亞單位疫苗是一種化學(xué)成分疫苗，由菌體抗原純化而來，不存在活疫苗帶來的安全問題。李建軍等[20]在2012年對H.parasuis血清5型的tbpA蛋白做了免疫原性的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外表達的tbpA蛋白能使小鼠產(chǎn)生高效價的抗體，具有很好的免疫及反應(yīng)原性，為亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。菌影疫苗是近年來新發(fā)展的一種新型的無細胞漿和核酸的空細菌體疫苗，不僅免疫原性高，又兼具佐劑的作用[21～22]。胡明明等[23～24]在2011年以血清5型副豬嗜血桿菌為載體，成功制備了H.Parasui菌影，并進行了免疫效力評價。

5 防治研究

HPS的防治措施主要包括抗生素治療和免疫接種。很多藥敏試驗表明HPS對頭孢類藥物、喹諾酮類藥物及慶大霉素敏感，對復(fù)方磺胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及氯霉素敏感性不是很穩(wěn)定，對四環(huán)素、氨芐青霉素具有耐藥性，但現(xiàn)今大多數(shù)病豬都為混合感染，抗生素的治療效果不是非常理想。免疫接種方面，目前商品滅活苗的保護效益相差極大，2013年張寧等[25]選取國外兩個知名廠家生產(chǎn)的兩種HPS滅活疫苗免疫差距較明顯，這可能是由于HPS血清型較多，且毒力差異較大，疫苗株與致病株血清型不同而缺乏交叉保護力。在自家滅活苗的研制中，宋鳳香等[26]在2010年從德州某大型豬廠分離到HPS，經(jīng)血清學(xué)鑒定為我國流行的血清5型，并制備了抗原含量為8×108CFU/mL的HPS油乳劑滅活疫苗，應(yīng)用于德州市5個規(guī)?；i場，結(jié)果表明HPS發(fā)病率由未免疫時的10.9%下降至1.9%，且5個豬廠HPS的發(fā)病率均控制在2.5%以下，證明地方株制備疫苗對防治該病有很好的效果。當然也與免疫過程有關(guān)，2005年鄧曉霞等[27]做了HPS滅活疫苗免疫效果觀察，該試驗將懷孕后期的母豬隨機分為3組，分為母、仔組免疫組；仔豬免疫組；非免疫組。結(jié)果證明母、仔組免疫組成活率和增重率高于仔豬免疫組高于非免疫組。

（13-27 略，需要者可向作者索取）

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