貴州茅臺(tái)酒高溫發(fā)酵工藝中酵母的應(yīng)激機(jī)制分析

◎何 宇

（貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)懷茅酒廠，貴州 仁懷 564501）

茅臺(tái)酒是我國(guó)國(guó)酒品牌之一，由于貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)獨(dú)特的水源、土壤以及氣候點(diǎn)等特，使得利用該地區(qū)微生物和水源釀制的醬香型白酒的味道獨(dú)特，留香持久。在釀制過(guò)程中主要是通過(guò)高溫制曲、堆積、發(fā)酵、流酒以及多刀蒸餾和發(fā)酵技術(shù)才能夠得出純正的茅臺(tái)酒，根據(jù)現(xiàn)代科技研究茅臺(tái)酒中所含有的微量元素種類(lèi)超過(guò)了1400種，是普通醬香型白酒的近3倍。

1 酵母在高溫發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)種類(lèi)

1.1 氧化應(yīng)激反應(yīng)

在釀酒過(guò)程中外界的環(huán)境很容易對(duì)菌體造成影響，使活性氧類(lèi)物質(zhì)大量累積，當(dāng)其累積到一定濃度后就會(huì)對(duì)酵母菌細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)產(chǎn)生破壞，如變性、斷裂蛋白質(zhì)鏈等，使細(xì)胞產(chǎn)生死亡。但酵母菌已經(jīng)進(jìn)化出能夠在此情況下保護(hù)自身的特性，主要利用酶類(lèi)或非酶類(lèi)物質(zhì)使其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)保持原始狀態(tài)，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)其影響。

1.2 高溫應(yīng)激反應(yīng)

茅臺(tái)酒在釀制過(guò)程中需要進(jìn)行高溫發(fā)酵，而通常酵母發(fā)酵的穩(wěn)定應(yīng)控制在33℃左右，最高不得超過(guò)36℃，但在發(fā)酵后期酒糟當(dāng)中的溫度必然無(wú)法有效控制，導(dǎo)致酶類(lèi)物質(zhì)因受熱而出現(xiàn)鈍化，使得發(fā)酵情況停止。而酵母菌本身耐熱應(yīng)激機(jī)制較為復(fù)雜，需要接觸耐熱蛋白、海藻糖、應(yīng)激糖蛋白等的幫助。

1.3 酒精應(yīng)激反應(yīng)

酵母對(duì)酒精的耐受度也有一定的限制，如果超過(guò)該臨界值就會(huì)毒害酵母菌。與高溫應(yīng)激反應(yīng)相似，高濃度酒精同樣能夠刺激酵母產(chǎn)生海藻糖，而海藻糖除了可以抵消高溫應(yīng)激反應(yīng)，還可以抵消酒精應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞膜的毒害作用，穩(wěn)定細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)活性。

2 茅臺(tái)酒高溫發(fā)酵工藝中酵母的應(yīng)激機(jī)制實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)所涉及的實(shí)驗(yàn)試劑包括無(wú)水乙醇、PMSF、Chaps、尿素、脲、Agarose NA、Tris、冰乙酸、鹽酸、十二烷基硫酸鈉、IAM、DTT、丙烯酰胺、NP40、甲醛、正丁醛、硝酸銀、麥芽糖、甘油、磷酸、戊二醛、過(guò)硫酸銨、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、氯化鈣、碳酸鈉以及甲醇等。所使用的實(shí)驗(yàn)器材則包括手持式折光儀、電子天平、恒溫水浴鍋、pH試紙、紫外分光光度儀、電熱干燥箱、真空干燥箱、液氮容器罐、磁力恒溫?cái)嚢杵?、萬(wàn)用爐、培養(yǎng)箱、大容量恒溫振蕩器、電泳儀、超聲細(xì)胞粉碎機(jī)、搖床以及離心機(jī)等。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配置

稱(chēng)取麥芽粉，將其按照1∶4的比例與水進(jìn)行混合，并在恒溫磁力攪拌器當(dāng)中進(jìn)行糖化，溫度設(shè)定在67℃，糖化時(shí)間為5 h，然后將液體用紗布進(jìn)行過(guò)濾。根據(jù)一份蛋清可以澄清1000ml糖化麥芽粉的比例添加蛋清，并放入水浴鍋中煮沸，再次利用紗布過(guò)濾，并在恒溫滅菌鍋內(nèi)滅菌30m in，放入冰箱內(nèi)備用。

2.2.2 菌種的活化和培養(yǎng)

將利用斜面保存的實(shí)驗(yàn)菌種接種在配置的麥芽培養(yǎng)基上，在30℃的恒溫條件下培養(yǎng)3d，獲得子一代菌種，然后再將其進(jìn)行轉(zhuǎn)接，同樣放置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)2d，獲得的菌種供實(shí)驗(yàn)使用。利用接種環(huán)分三次將適量的菌種接種在麥芽培養(yǎng)基上，在溫度設(shè)定為30℃的恒溫振蕩器當(dāng)中以每分鐘170 r的頻率培養(yǎng)10 h，并根據(jù)每250 ml麥芽培養(yǎng)基上接種振蕩培養(yǎng)總量6%的接種量將其進(jìn)行轉(zhuǎn)接，以同樣的條件在恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得實(shí)驗(yàn)用種菌液。

2.2.3 酵母存活率的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的酵母細(xì)菌分成若干等分，同時(shí)使其接受高溫和酒精的刺激，每種刺激時(shí)間約為0.5h。使用消毒的蒸餾水將菌液分別稀釋1～5倍，取稀釋后的菌液進(jìn)行涂板。每個(gè)濃度的菌液分別平行涂板三次，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)約32 h，將其與未產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的酵母菌進(jìn)行對(duì)比。

2.2.4 蛋白質(zhì)的定量

將培養(yǎng)后收集的菌體轉(zhuǎn)移到容量為15 ml的離心管當(dāng)中，用10 ml的無(wú)菌蒸餾水對(duì)其進(jìn)行清洗，在振蕩均勻后禁止沉淀。隨后在恒溫離心機(jī)內(nèi)離心約5 min，溫度設(shè)定為10℃，速率為2000 r，保留沉淀物質(zhì)。重復(fù)離心兩次后保留沉淀物質(zhì)，并加入1 ml的無(wú)菌蒸餾水溶解，再次用每分鐘3000 r的速率進(jìn)行離心，保留沉淀物獲得實(shí)驗(yàn)測(cè)量的蛋白質(zhì)。在試管當(dāng)中加入蛋白質(zhì)抑制劑，消除其蛋白質(zhì)的增多，并利用冰浴超聲破碎方法打破其細(xì)胞壁，約破碎10 min，并利用每分鐘2000 r的速率進(jìn)行離心，保留上清液。在上清液當(dāng)中加入5倍體積的丙酮混合液，在零下20℃條件下沉淀，離心后保留沉淀物，再次用丙酮將混合液中的TCA洗脫，二次冷藏和離心，重復(fù)操作兩次后保留沉淀物。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株在培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中兩種酵母菌株的生長(zhǎng)延滯期數(shù)據(jù)相差不大，但是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期當(dāng)中釀酒酵母的生長(zhǎng)速率明顯要高于普通酵母，菌體的數(shù)量也達(dá)到了峰值。以單純高溫對(duì)菌株進(jìn)行刺激的實(shí)驗(yàn)可以看出，在48℃連續(xù)刺激30～40 min菌株的活性最大，說(shuō)明此時(shí)其呼吸能力較強(qiáng)，但隨著高溫刺激時(shí)間增加，菌株活性減弱，在超過(guò)60 min時(shí)活性降低到最低點(diǎn)，說(shuō)明酵母菌發(fā)生死亡。而在單純酒精刺激時(shí)，在20～30 min之間菌株的活性最強(qiáng)，并且在30 min時(shí)活性達(dá)到峰值，但之后隨著刺激時(shí)間的增加菌株的活性明顯下降。利用高溫和酒精雙重因素刺激時(shí)，溫度控制在46℃，酒精濃度為2%，此時(shí)在刺激20 min后菌株活性達(dá)到峰值，隨后降低。

3 結(jié)語(yǔ)

茅臺(tái)酒高溫發(fā)酵當(dāng)中酵母的應(yīng)激機(jī)制與溫度和酒精有著很大的聯(lián)系，有效控制發(fā)酵時(shí)間和菌株品種的選擇能提升發(fā)酵效果。

[1]季克良,郭坤亮.剖讀茅臺(tái)酒的微量成分[J].釀酒科技,2012(10).

[2]路玲玲,檀建新.高溫和高酒精濃度下的酵母特性[J].中國(guó)釀造,2014(9).