P47phox基因第4外顯子多態(tài)性與湖南省漢族人群腦梗死的相關(guān)研究*

黃曉松，羅銀利，譚李紅，陳媛

（1.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 研究生教育學(xué)院，湖南 長沙 410007）

P47phox基因第4外顯子多態(tài)性與湖南省漢族人群腦梗死的相關(guān)研究*

黃曉松1，羅銀利1，譚李紅1，陳媛2

（1.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 研究生教育學(xué)院，湖南 長沙 410007）

目的探討P47phox基因第4外顯子G338A（Arg90His）和G457A（Thr129Thr）多態(tài)性與湖南省漢族人群腦梗死的相關(guān)性。方法采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)和DNA直接測序法檢測湖南省漢族人群散發(fā)性腦梗死患者110例、10個腦梗死家系成員110例及100例健康對照組的P47phox基因第4外顯子G338A和G457A多態(tài)性。酶法測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），免疫比濁法測定apoA-I及apoB100，ELISA法測定Lp（a）血清水平。結(jié)果p47phox基因第4外顯子G338A多態(tài)存在GG、GA和AA 3種基因型，腦梗死組及其各亞型組G338A多態(tài)A等位基因頻率分布與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；G457A多態(tài)存在GG和GA兩種基因型，腦梗死組及其各亞型組G457A多態(tài)基因頻率分布與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腦梗死組及其各亞型組血清TC、TG、LDL-c及Lp（a）水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；組內(nèi)不同基因型間血脂、脂蛋白水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論p47phox基因G338A多態(tài)A等位基因可能是腦梗死，特別是有高血壓病性和糖尿病性腦梗死患者的一個危險因素；G457A多態(tài)可能與腦梗死的發(fā)病無關(guān)。p47phox基因G338A 和G457A多態(tài)性與血脂代謝可能有關(guān)。

腦梗死；P47phox；第4外顯子；基因多態(tài)性；血脂

缺血性腦卒中已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，遺傳因素在其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用［1］。P47phox是NAD（P）H氧化酶一個重要的亞基，在誘導(dǎo)NAD（P）H氧化酶活化，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過程中發(fā)揮重要作用［2］，而活性氧是缺血性腦卒中、高血壓等血管性疾病發(fā)病的危險因素［3-8］。P47phox基因的編碼區(qū)存在多種遺傳多態(tài)位點，其中位于第4外顯子的G338A （Arg90His）和G457A（Thr129Thr）多態(tài)性與ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)和DNA直接測序法檢測湖南省漢族散發(fā)性腦梗死患者、腦梗死家系成員及正常人群的P47phox基因第4外顯子G338A和G457A多態(tài)性，從而探討其與腦梗死的相關(guān)性及對血脂代謝的影響。

1　資料與方法

1.1研究對象

1.1.1正常對照組選取無血緣關(guān)系的正常健康人共100例。其中男54例，女46例；最大年齡75歲，最小年齡21歲，平均（56.3±13.2）歲。均為湖南省第二人民醫(yī)院健康體檢人員，病史詢問無腦卒中家族史，無肝、腎、血液病、自身免疫性疾病和甲狀腺病史。

1.1.2散發(fā)性腦梗死組選取無家族聚集現(xiàn)象的散發(fā)性腦梗死患者共110例。男63例，女47例，最大年齡86歲，最小年齡32歲，平均（57.2±13.5）歲。其中腦血栓形成組（cerebral thrombosis，CT）及腔隙性腦梗死組（lacunar infarction，LI）分別為77例和33例；有高血壓的腦梗死組（HBP+CI）及無高血壓的腦梗死組（非HBP+CI）分別為78和32例；有糖尿病的腦梗死組（DM+CI）及無糖尿病的腦梗死組（非DM+CI）分別為10和100例。均為湖南省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2012年6月-2014年1月住院和門診患者。所有病例均符合1995年全國第4次腦血管疾病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，經(jīng)頭顱CT或MRI確診。不包括心源性、動脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等引起的腦卒中；排除患有嚴(yán)重肝腎疾病、甲狀腺疾病、血液病和最近3個月服用雌激素患者，近2周均未服用降血脂藥和抗凝藥。

1.1.3腦梗死家系組收集10個腦梗死家系共包括成員110例。先證者為湖南省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2012年6月-2014年1月住院和門診，其中，男61例，女49例，最大年齡78歲，最小年齡15歲，平均（55.4±12.6）歲。其中患病者42例，未患病者68例。

1.2方法

①人基因組DNA樣品的制備：抽取研究對象外周靜脈血4 ml，肝素抗凝，用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA。②P47phox基因型檢測：擴(kuò)增P47phox基因第4外顯子的引物經(jīng)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，所得引物序列為：正向引物：5'-TCCCAAGTGGTTTGACG G-3'；反向引物:5'-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3'。反應(yīng)在PE4800型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，93℃變性40 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72℃充分延伸10 min，反應(yīng)管冷卻至4℃。③單鏈構(gòu)象多態(tài)分析：取4μl PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物，如特異性好，則將PCR產(chǎn)物加等量2×變性載樣緩沖液，混合后95℃變性10 min，然后立即置冰上5 min，取8μl上樣于含5%甘油的8%49∶1的中性聚丙烯酰胺凝膠中，160 V電壓4℃電泳10 h，電泳結(jié)束后采用銀染法染色并拍照。選取中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中有異常泳帶的陽性樣本進(jìn)行正反向測序。測序結(jié)果在GenBank和SNP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較分析。④血脂和脂蛋白的測定：采用氧化酶法測定三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）；免疫比濁法測定載脂蛋白A-I （apoA-I）及載脂蛋白B100（apoB100）；ELISA法測定血清脂蛋白a［Lp（a）］水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有資料在Dbase軟件中建立數(shù)據(jù)庫，等位基因頻率=（2×純合子+雜合子）/（2×受檢人數(shù)），基因型頻率和等位基因頻率的差異用χ2檢驗或有關(guān)校正方法。按Hardy-Weinberg平衡法檢驗樣本的群體代表性。組間血脂比較用t檢驗，不同基因型亞組間血脂比較用ANOVA方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腦梗死組和對照組的臨床特點

腦梗死組、腦梗死家系組兩組中有高血壓病史、糖尿病病史者高于對照組（P＜0.01），腦梗死組和腦梗死家系組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組在年齡、性別構(gòu)成、體重指數(shù)、吸煙及飲酒史差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

表1　腦梗死組和對照組臨床資料比較

圖1　G338A（Arg90His）GG基因型反向測序圖 （箭頭所指）

圖2　G338A（Arg90His）GA基因型反向測序圖 （箭頭所指）

圖3　G338A（Arg90His）AA基因型反向測序圖（箭頭所指）

2.2P47phox基因第4外顯子G338A多態(tài)性分析P47phox基因第4外顯子G338A有3種不同的電泳圖譜，經(jīng)測序后證實分別為GG，GA和AA 3種基因型（見圖1～3）。

2.3 P47phox基因第4外顯子G457A多態(tài)性分析

P47phox基因第4外顯子G457A有兩種不同的電泳圖譜，經(jīng)測序后證實分別為GG和GA兩種基因型（見圖4～5）。

2.4 P47phox基因G338A多態(tài)分布

腦梗死組與對照組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＞0.05）。腦梗死組及其各亞型組、腦梗死家系組中患病與未患病與對照組G338A多態(tài)A等位基因頻率分布比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

2.5P47phox基因G457A多態(tài)分布

腦梗死組與對照組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＞0.05）。腦梗死組及其兩組各自亞型組與對照組G457A多態(tài)基因頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

圖4　G457A（Thr129Thr）GG基因型反向測序圖（箭頭所指）

圖5　G457A（Thr129Thr）GA基因型反向測序圖（箭頭所指）

表2　腦梗死組亞型間p47phox基因4號外顯子G338A（Arg90His）多態(tài)分布

2.6 P47phox基因G338A和G457A多態(tài)對血脂、脂蛋白水平的影響腦梗死組血清TC、TG、LDL-C及Lp（a）水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；組內(nèi)不同基因型間血脂、脂蛋白水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4～5。

表3　腦梗死組亞型間p47phox基因4號外顯子G457A（Thr129Thr）多態(tài)分布

表4　腦梗死組p47phox基因G338A（Arg90His）不同等位基因?qū)ρ椭鞍姿降挠绊?（x±s）

表5　腦梗死組p47phox基因G457A（Thr129Thr）多態(tài)不同等位基因?qū)ρ椭鞍姿降挠绊?（x±s）

3　討論

NADPH氧化酶即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，又稱還原型輔酶Ⅱ氧化酶，其由催化亞基gp91phox，跨膜亞基p22phox，胞漿亞基p47phox、p67phox、p40phox、小G蛋白Rac和RaplA等組成的酶復(fù)合體。研究發(fā)現(xiàn)［10］，NADPH氧化酶可能是體內(nèi)生成ROS的主要酶體。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞質(zhì)亞基p47phox轉(zhuǎn)位至胞膜，與膜上亞基結(jié)合激活NADPH氧化酶［11］，激活后的NADPH氧化酶經(jīng)過系列反應(yīng)產(chǎn)生ROS?？梢姡琑OS的產(chǎn)生過程p47phox發(fā)揮了始動功能［12］。p47phox即吞噬細(xì)胞氧化酶47千道爾頓蛋白質(zhì)，又名嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)因子1（neutrophil cytosol factor 1，NCF-1），其功能區(qū)由5個功能域組成，翻譯產(chǎn)物是一個長度為399個氨基酸的片段［13］。目前研究發(fā)現(xiàn)，ROS可刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管細(xì)胞黏附分子（vas cularcell adhesion molecule-1，VCAM-1）、單核細(xì)胞趨化因子（mon-ocyte chemoattractant protein，MCP-1）等細(xì)胞因子，使單核細(xì)胞向血管壁聚集，形成泡沫細(xì)胞，反過來泡沫細(xì)胞又可以釋放氧和過氧化氫。另外，中等量的ROS產(chǎn)物可作為細(xì)胞內(nèi)的第2信使，通過激活血管平滑肌細(xì)胞與生長相關(guān)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)引起血管平滑機(jī)細(xì)胞的增生；并通過調(diào)節(jié)平滑肌基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （MMP-9）的活性，參與血管重塑及引起斑塊破裂［14-16］，因此它與血管性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。也有研究發(fā)現(xiàn)活性氧與缺血性卒中、動脈粥樣硬化的形成、高血壓、高脂血癥、糖尿病等疾病密切相關(guān)，是血管性疾病的危險因素［3-8］?？梢?，p47phox與高血壓病、動脈粥樣硬化形成和缺血性卒中等血管性疾病和糖尿病、高脂血癥密切相關(guān)。若編碼NAD（P）H氧化酶亞單位的基因多態(tài)性或基因突變使ROS生成增加，就可能通過直接氧化作用和間接作為第2信使參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)加速動脈粥樣硬化形成、高血壓病、糖尿病和高脂血癥的發(fā)生與發(fā)展，從而使其對腦卒中的易感性增加。

P47phox在ROS產(chǎn)生過程中的功能PX區(qū)和兩個SH-3區(qū)密切相關(guān)，而第 4號外顯子上 G338A （Arg90His）、G457A（Thr129Thr）多態(tài)是其中的多態(tài)位點。本研究結(jié)果顯示，在中國湖南省漢族人群中G338A（Arg90His）多態(tài)位點有GG，GA和AA 3種基因型；G457A（Thr129Thr）多態(tài)位點有GG、GA兩種基因型，未發(fā)現(xiàn)AA基因型。目前該兩個多態(tài)位點在不同人種的分布情況國內(nèi)外尚未見報道，并且G457A（Thr129Thr）為首次發(fā)現(xiàn)的新多態(tài)位點。在研究P47phox第4外顯子多態(tài)位點與湖南漢族人群腦梗死相關(guān)性中發(fā)現(xiàn)，腦梗死組及其各亞型組、腦梗死家系中患病組與未患病組G338A多態(tài)A等位基因頻率分布與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。腦梗死組及其各亞型組、腦梗死家系中患病組與未患病組G457A多態(tài)基因頻率分布與對照組比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果提示p47phox基因G338A多態(tài)A等位基因可能是腦梗死，尤其是有高血壓病的、有糖尿病的腦梗死患者的一個危險因素；P47phox基因G457A多態(tài)性可能與腦梗死無關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，腦梗死組及其各亞型組血清TC、TG、LDL-C及Lp（a）水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；組內(nèi)不同基因型間血脂、脂蛋白水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?，湖南省漢族人群P47phox基因第4號外顯子多態(tài)性可能與血脂代謝有關(guān)。

筆者推測可能是 P47phox基因第4號外顯子G338A多態(tài)A等位基因的表達(dá)，導(dǎo)致338位點密碼子突變（G→A），發(fā)生非同義突變，將精氨酸置換為組氨酸，從而引起腦梗死患者P47phox分子結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生功能增強(qiáng)，產(chǎn)生過多的活性氧。過多的ROS通過直接氧化作用和間接作為第2信使參與信號傳遞加速動脈粥樣硬化形成、高血壓病和糖尿病的發(fā)生與發(fā)展，從而使其對腦梗死的易感性增加。P47phox基因第4號外顯子G457A多態(tài)表達(dá)，457位點密碼子突變（G→A），發(fā)生同義突變，導(dǎo)致相應(yīng)的457位氨基酸由蘇氨酸置換為蘇氨酸，可能引起腦梗死患者P47phox分子結(jié)構(gòu)改變，但對NAD（P）H氧化酶產(chǎn)生ROS的功能可能無影響，也許與本研究的種群和方法有關(guān)，其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（張蕾 編輯）

Relationship between polymorphisms of p47phoxgene exon 4 and cerebral infarction in Hunan Han population*

Xiao-song HUANG1，Yin-li LUO1，Li-hong TAN1，Yuan CHEN2
（1.The Second People's Hospital of Hunan Province，Changsha，Hunan 410007，P.R.China；2.School of Graduate Education，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，P.R.China）

【Objective】To investigate the relationship between polymorphisms of G338A（Arg90His）and G457A（Thr129Thr）of p47phoxgene exon 4 and cerebral infarction（CI）in Hunan Han population.【Methods】The G338A and G457A polymorphisms of p47phoxgene exon 4 in 110 patients with cerebral infarction（CI），100 sex-and age-matched healthy controls and 10 CI pedigrees from Hunan Han population were determined by PCR-single strand conformation polymorphism analysis and DNA sequencing.TC，TG，HDL-C and LDL-C levels were tested using enzymatic method；apoA-I and apoB100 were measured with immunoturbidimetry；and plasma lipoprotein（a）［Lp（a）］level was measured by ELISA.【Results】Three gene types GG，GA and AA were found in the G338A polymorphism site of p47phoxgene exon 4.Statistically significant differences were found in the frequencies of A allele of G338A polymorphism between the CI groups and the control group（P＜0.01）.Two gene types GG and GA were found in the G457A polymorphism site of p47phoxgene exon 4.No statistically significant differences were found in the frequencies of genotypes and alleles of G457A polymor－phism between the CI groups and the control group（P＞0.05）.The serum levels of TC，TG，LDL-C and Lp（a）of the CI groups were markedly higher than those of the control group（P＜0.01）.【Conclusions】An allele in G338A polymorphism of p47phoxgene exon 4 may be one of the risk factors of CI patients，especially the CI patients accompanied with hypertension or diabetes.The gene G457A is probably not related with the onset of CI.TheG338AandG457Apolymorphismsofp47phoxgeneareprobablyassociatedwithplasmalipid metabolism.

cerebral infarction；p47phox；exon 4；gene polymorphism；plasma lipid

R743.33

A

1005-8982（2015）33-0020-07

2015-06-26

湖南省衛(wèi)生廳資助課題（No：B2010-086）

譚李紅，E-mail：tanlihong118@163.com